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KR-20260060530-A - Novel peptide for specific detection of Sclerostin

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Abstract

본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 스클레로스틴과 특이적으로 결합할 수 있어 스클레로스틴을 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 스클레로스틴에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한바, 이를 스클레로스틴 검출, 또는 골 형성을 억제하는 스클레로스틴 관련 질환 진단을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Inventors

  • 박종필
  • 양효정

Assignees

  • 중앙대학교 산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241024

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 스클레로스틴(Sclerostin) 검출용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 스클레로스틴 검출용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출용 조성물은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 스클레로스틴 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 키트.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 스클레로스틴 검출용 바이오칩.
  9. 제8항에 있어서, 상기 바이오칩은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오칩.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계를 포함하는, 스클레로스틴 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파 전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA (Lateral flow assay)/VFA (variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는, 골다공증(Osteoporosis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis) 등과 같은 골관절 질환 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 진단용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.

Description

스클레로스틴 검출용 신규한 펩타이드{Novel peptide for specific detection of Sclerostin} 본 발명은 스클레로스틴 검출용 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다. 스클레로스틴(Sclerostin)은 조골세포의 분화, 증식을 유발하는 Wnt 신호전달을 방해함으로써 새로운 뼈 생성을 억제하여 골다공증을 유발하는 주요 인자로 보고되어 있는 작은 단백질이다. 스클레로스틴은 골세포와 관절 연골세포에 의해 발현되는 SOST 유전자의 산물이며 Wnt 신호전달의 내인성 억제제로도 알려져 있다. SOST 유전자는 관절 연골세포에서도 발현되며 이 유전자의 활성 조절이 관절 연골 및 연골 하 뼈에 영향을 미치게 된다. 스클레로스틴은 SOST 유전자에 의해 암호화되며 BMP가 수용체에 결합하는 것을 억제함으로써 BMP (뼈 형태발생 단백질) 길항제로 간주된다. 스클레로스틴이 조골세포 표면의 수용체에 결합하면 세포 내 신호전달의 하류 단계가 시작되어 궁극적으로 조골세포의 뼈 형성을 억제하는 효과를 나타내기에 골다공증 치료를 위한 표적으로 떠오르고 있다. 골다공증은 뼈의 미세구조를 파괴하고, 뼈의 강도와 골질량을 감소시키는 역할을 하며, 골절 위험과 심각한 합병증, 사망에까지 이르게 하기에 스클레로스틴의 신속하고 정확한 검출은 골다공증, 류마티스 관절염 등 골관절 질환의 임상 진료에 있어 중요한 요소로 인식되고 있다. 현재까지 스클레로스틴을 검출하기 위한 다양한 연구들이 진행되었다. 대표적으로, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer), 항체(antibody) 등을 이용한 전기화학적(Electrochemical analysis) 분석기술, 전기화학발광 (Electrochemiluminescence method) 분석기술, SPR (surface plasmon resonance) 방법, LFA (Lateral Flow Assay) 기술, fluorescent assay, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 기술과 크로마토그래픽 (chromatographic methods) 방법 등을 사용하여 스클레로스틴을 검출하려는 다양한 연구들이 보고되었다. 그러나 상기 방법들은 스클레로스틴에 대한 민감도와 선택성이 다소 낮은바, 스클레로스틴을 특이적으로 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다. 도 1은 본 발명에 따라 선별된 박테리오파지의 스클레로스틴에 대한 결합력을 확인한 결과이다. 도 2는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 도 3은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지의 스클레로스틴 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 도 4는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지의 골드칩(gold chip) 고정화 가능 여부를 확인한 결과이다. 도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 도 6은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 스클레로스틴 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 도 7은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 스클레로스틴에 대한 결합 상수를 확인한 결과이다. 도 8은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 스클레로스틴에 대한 특이성을 확인한 결과이다. 도 9는 본 발명에 따른 새로 합성된 펩타이드 수용체를 골드칩에 고정한 후, 펩타이드 수용체의 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 도 10은 본 발명에 따른 새로 합성된 펩타이드 수용체를 골드칩에 고정한 후, 이의 스클레로스틴 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다. 이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 스클레로스틴을 특이적으로 검출할 수 있는 펩타이드에 대한 것으로, 하기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 스클레로스틴(Sclerostin) 검출용 펩타이드를 제공한다. YSWSLTVPNYNR (서열번호 1). 상기 서열번호 1로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 M13 박테리오파지(bacteriophage)의 게놈 중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산을 갖는 선형 모형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현하도록 제작된 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.-12 (New England BioLab)를 이용하여 스클레로스틴에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 상기 M13 박테리오파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노 크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 친화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아 박테리오파지를 이용하는 경우, 견고하고 열에 안정한 박테리오파지의 특성을 이용하여 화학적 링커를 통해 쉽고 빠르게 변환기 표면에 고정될 수 있어 생체분자와 결합하기 쉬워 센서 개발에 큰 장점이 된다. 또한 제조 공정이 간단하여 생산성과 안정성의 향상에 기여하며 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작으므로 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC (9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC (tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술 분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다. 상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고,