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KR-20260060539-A - Gene cassettes for producing antigenic mRNA in the cytoplasm and uses thereof

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Abstract

본 발명은 세포질에서의 목적 단백질의 발현을 위한 유전자 전달 시스템으로서, 특히 T7 프로모터와 T7 RNA 폴리머라아제의 특이적 결합을 통해 작동되는 유전자 카세트 및 이를 이용한 타겟 단백질의 전사 및 발현이 세포질에서 이루어지도록 하기 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도에 대한 것이다.

Inventors

  • 안형준
  • 신상철
  • 조상원

Assignees

  • 한국과학기술연구원

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241024

Claims (12)

  1. T7 프로모터 및 T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA(ds DNA)를 포함하는 T7 오토진 카세트(T7 autogene cassette); 및 T7 프로모터 및 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA(dsDNA)를 포함하는 항원 생산 카세트(antigen-producing cassette)를 포함하는 유전자 전달 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T7 오토진 카세트(T7 autogene cassette)는 핵 내 전사를 위하여, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40 (Simian Virus 40) 프로모터, EF1α (Elongation Factor 1 alpha) 프로모터, UbC (Ubiquitin C) 프로모터, PGK (Phosphoglycerate Kinase) 프로모터, CAG 프로모터, hTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase) 프로모터 또는 HSV-TK (Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase) 프로모터 중 선택되는 프로모터를 포함하는 것인, 유전자 전달 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 T7 오토진 카세트는 핵유입신호(NIS) 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 전달 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 T7 오토진 카세트는 핵 또는 세포질에서 전사 및 발현이 이루어지는 것인, 유전자 전달 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원 생산 카세트(antigen-producing cassette)는 세포질에서 발현되기 위한 목적 단백질 암호화 서열을 포함하는 것인, 유전자 전달 시스템.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 T7 오토진 카세트 또는 항원 생산 카세트는 EIB(Extended Initiation Bubble), IVS (Intervening sequence), IRES (Internal Ribosome Entry Sites), 3'UTR 또는 poly A 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 전달 시스템.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 T7 오토진 카세트 또는 항원 생산 카세트에 포함되는 이중나선 DNA는 핵산 분해효소에 의한 저항성을 가지기 위하여 3' 또는 5' 말단이 변형된 것인, 유전자 전달 시스템.
  8. 제1항의 유전자 전달 시스템 및 세포 내 전달을 위한 전달체를 포함하는 유전자 전달 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전달체는 지질 나노입자(LNP, Lipid Nanoparticles), PLGA(Poly(lactic-co-glycolic acid), 리포좀, 엑소좀, 세포투과성 펩타이드, 금 나노 입자 또는 실리카 나노입자 기반 전달체, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함하는 군에서 선택되는 것인, 유전자 전달 복합체.
  10. T7 오토진 카세트가 핵 내에서 RNA 폴리머라아제 mRNA를 전사하는 단계; 상기 T7 RNA 폴리머라아제 mRNA가 세포질로 방출되어 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 단계; 및 상기 T7 RNA 폴리머라아제가 항원 생산 카세트의 T7 프로모터와 결합하여 세포질에서 목적 단백질을 전사 및 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 목적 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크(spike) 단백질인 것인, 목적 단백질의 생산 방법.
  12. 제1항의 유전자 전달 시스템을 포함하는 백신 조성물.

Description

세포질에서 항원 mRNA를 생산하기 위한 유전자 카세트 및 이의 용도 {Gene cassettes for producing antigenic mRNA in the cytoplasm and uses thereof} 본 발명은 세포질에서 mRNA 생산 및 목적 단백질 발현을 위한 유전자 전달 시스템에 대한 것으로, 구체적으로, T7 RNA 중합효소(T7 RNA 폴리머라아제)와 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 두 종류의 이중 가닥 DNA(dsDNA)을 포함하는 유전자 전달 시스템 및 상기 유전자 전달 시스템의 용도에 대한 것이다. 백신은 다양한 종류가 있으며, 크게 생백신, 사백신, 서브유닛 백신, 유전자 기반 백신, 바이러스 벡터 백신 등으로 나눌 수 있다. 특히 최근 코로나 바이러스와 같은 신종 감염병에 대한 대응으로, 다른 원리와 기술을 사용하는 다양한 형태의 백신이 개발되고 있는 실정이며, 아래와 같은 유형의 백신이 실제 출시되어 있다. - mRNA 백신: SARS-CoV-2 바이러스의 특정 단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한다. 이 mRNA가 신체에 주입되면 백신 수신자의 세포에서 해당 단백질을 생산하고 이를 통해 면역반응이 유도된다. 화이자-바이오엔테크와 모더나가 개발한 백신이 이 유형에 속한다. 직접 감염원을 다루지 않아 안전성이 높고 신속한 개발 및 생산이 가능한 장점이 있으나 mRNA 자체의 불안정성과 생체내 전달이 비효율적이라는 한계를 가진다. 특히 mRNA 고유의 불안정성으로 인하여 백신이 -70 ℃와 같은 극 초저온 조건에서 보관 및 운송해야 하므로 이러한 조건이 갖춰지지 않은 지역에서 사용하기 어렵다. - 바이러스 벡터 백신: 벡터 백신은 본래 다른 바이러스 (예, 아데노 바이러스)를 수정하여 SARS-CoV-2의 일부를 전달한다. 수정된 바이러스는 감염력이 없지만 바이러스의 단백질을 표면에 노출시키며, 이를 통해 면역 반응을 유도한다. 얀센과 아스트라제네카의 백신이 벡터 백신에 속한다. 바이러스 벡터 자체에 의한 면역반응이 원치 않는 여러가지 부작용 문제를 일으킨다. - 단백질 서브 유닛 백신: 바이러스의 특정 부분인 단백질 서브 유닛을 주입하여 면역 반응을 유도한다. 이 부분은 바이러스 전체가 아니기 때문에 안전하게 사용될 수 있다. 노바백스 백신이 이 유형에 속한다. 면역 원성이 낮은 문제를 해결하기 위해 어쥬번트의 사용이 필요하다. - DNA 백신: 박테리아 유래의 플라스미드에 SARS-CoV-2의 일부를 전달하고 이러한 플라스미드가 신체에 주입되면 백신 수신자의 세포에서 해당 단백질을 생산하고 이를 통해 면역반응이 유도된다. 직접 감염원을 다루지 않아 안전성이 높고 신속한 개발 및 생산이 가능하지만 생체 내 전달이 비효율적이고 세포핵 내로 이동이 필요하다는 제약을 받는다. 특히 세포막을 통과한 후 세포핵 내로의 플라스미드 전달은 매우 낮은 효율을 가지기에 항원 생산효율이 낮다는 한계를 갖는다. - 불활성화 또는 약독화 백신: 바이러스를 감염을 일으키지 않게끔 열처리 혹은 화학약품 처리를 한 후 신체에 주입하면 면역시스템은 이를 감지하고 항체 및 특이한 면역세포를 유도한다. 불활성화된 바이러스는 병을 일으키지 않으므로 비교적 안전하게 사용될 수 있으며, 상대적으로 안정적으로 보관하고 배포할 수 있다. 전형적인 예로는 인플루엔자 백신, 파상풍 백신 등이 이 유형에 속한다. - Virus like particle (VLP) 백신: 실제 바이러스의 핵산 (DNA 또는 RNA)을 제거하거나 비활성화 시키고 바이러스 본질의 구조가 유도되도록 하여 주입하면 면역 시스템에 실제 바이러스 입자처럼 감지된다. VLP는 바이러스의 감염 능력이 없기 때문에 안전하게 사용될 수 있다. HPV 백신과 HBV 백신이 이 유형에 속한다. 바이러스 입자의 구조를 유지하기 위한 최적의 조립조건이 필요하다는 단점을 가진다. - Self-amplifying RNA 백신: 일반적인 mRNA 백신과는 다르게 자체 복제 능력을 가진다. 복제에 필요한 항원 유전자와 함께 항원을 부호화하는데 필요한 부가적인 요소를 포함하는데, 이러한 요소들은 백신을 주입한 후 수용체 세포 내에서 자체적으로 복제되고, 결과적으로 더 많은 항원이 생성되고 면역 반응이 강화된다. 1회 접종만으로 항체를 충분히 형성할 수 있으나 제어가 어렵고 고품질의 RNA 생산이 어렵다. 기존의 백신 개발에서의 미충족 의료 수요를 향상시키려는 노력들은 위에서 언급한 바처럼 다양한 백신 플랫폼의 개발로 이어져왔다. 그러나 각각의 백신 기술마다 예방효과, 안전성, 최소 부작용 특성 등에서 타협이 불가피하였고, 그러하기에 안전도, 면역반응성, 백신 보관, 효과 지속 기간, 운반 등에서 각기 장점과 단점이 있다. 따라서 더 좋은 장점이 있는 최고 성능의 백신 플랫폼 개발이 지속적으로 요구된다. 따라서 새로운 백신 플랫폼에 요구되는 기술사항으로는 다음의 요소들이 고려되어야 한다. - 신속한 백신 구성이 가능하도록 비교적 간단한 생산공정이 요구됨. - 바이오리액터를 사용하지 않는 생산공정을 가져서 bacterial endotoxin과 같은 오염가능성이 없을 것. - 생산공정의 표준화 가능하며 대량생산이 가능할 것. 특히 빠른 시간에 많은 양의 백신 생산이 가능할 것. - 핵산 구조체의 독자 설계, 정제법 개선 등을 통한 특허회피가 가능할 것. - 예방용 백신 뿐만 아니라 암면역 백신을 포함하는 백신 관련 전 분야에 활용 가능한 단백질 발현 플랫폼이 개발될 것. - 백신 플랫폼의 손쉬운 변형을 통해 변종 바이러스에 효과적 대응이 가능할 것. - 기존 차세대 백신 플랫폼 방식 (mRNA 백신, DNA 백신 각각)의 미충족 의료 수요를 해결할 수 있을 것. 특히 mRNA 백신의 mRNA 자체의 고유 안전성 및 핵산 분해 효소의 공격에 대하여 취약한 문제점은 mRNA 백신의 한계를 보여준다. 또한 DNA 백신은 항원 발현 플라스미드의 크기가 크기 때문에 핵막으로의 전달효율이 매우 떨어질 수밖에 없고 결국 항원 단백질의 생산효율이 매우 저조하다는 한계를 보여준다. 특히 국내에서 코로나 백신의 경우 아직 임상 시험을 진행중이거나, 다양한 사유로 사업화에 성공하지 못하였으며, 기존의 백신 플랫폼 방식은 이미 글로벌 거대 제약사들이 선점한 높은 특허 장벽으로 국내 후발 제약사들의 개발 참여가 어려운 실정이다. 따라서, 앞으로도 발생할 수 있는 다양한 신종 감염병에 대비하여 백신 주권 확보를 위해서는 독자적인 백신 플랫폼의 개발이 절대적으로 필요하다. 도 1A는 T7 오토진 카세트를 포함하는 템플릿 벡터를 제조하기 위하여 T7 오토진 카세트를 구성하는 DNA 서열을 5개로 나누어서 303bp, 690bp, 581bp, 1566bp, 1410bp 크기로 화학적으로 합성하고 각각을 PCR 반응으로 증폭한 것을 agarose 전기 영동으로 크기를 확인한 결과이다 (a', b', c', d', e' 밴드 각각). 도 1B는 루시퍼라아제-생산 카세트(luciferase-생산 카세트)를 포함하는 템플릿 벡터를 제조하기 위하여 루시퍼라아제-생산 카세트를 구성하는 DNA 서열을 3개로 나누어서 312bp, 581bp, 1100bp 크기로 화학적으로 합성하고 각각을 PCR 반응으로 증폭한 것을 아가로스 전기영동으로 크기를 확인한 결과이다 (f', g', h' 밴드 각각). 도 1C는 T7 오토진 템플릿 벡터에 삽입된 T7 오토진 카세트 DNA 서열 및 루시퍼라아제-생산 템플릿 벡터에 삽입된 루시퍼라아제-생산 카세트 DNA 서열 각각을 PCR 반응으로 증폭하고 아가로스 전기영동으로 크기를 확인한 결과이다 (a'- b'- c'- d'- e' 밴드 및 f'- g'- h' 밴드). 도 2A는 Rpol (=T7 오토진 카세트) 및 luc (=luc-생산 카세트)의 PCR 생성물은 tDT 반응시간이 15분 및 30분 모두에서, 그리고 substrate인 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트가 1:1000 및 1:5000 몰 비 조건 모두에서 효과적으로 3' 말단에 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트이 결합됨을 아가로스 전기영동을 통해 보여준다. 도 2B는 tDT 반응시간이 15분일 때, 그리고 substrate로 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트 혹은 2'-메톡시 아데노신 트리포스페이트을 1:1000 몰비로 반응시켰을 때, Rpol 및 luc 모두 효과적으로 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트 혹은 2'-메톡시 아데노신 트리포스페이트이 결합됨을 보여준다. 도 2C는 Rpol (=T7 오토진 카세트), luc (=luc-생산 카세트) 및 스파이크 (=스파이크-생산 카세트)의 PCR 생성물이 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (terminal deoxynucleotidyl transferase) 20 unit과 15분 반응조건에서 substrate로 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트을 1:1000 몰비로 섞어주었을 때 효과적으로 2'-메톡시 구아노신 트리포스페이트가 결합됨을 보여준다. 도 3A와 3B는 0.8U T7 엑소뉴클라아제와 0.1 pmol T7 오토진 카세트 (혹은 루시퍼라아제-생산 카세트)를 37 ℃에서 다양한 시간 동안 반응시킨 후 아가로스 전기영동을 한 결과이다. 대조군으로 PCR 반응에 사용되는 primer에 포스포티오네이트 결합 대신 정상적인 포스포다이에스터 결합을 갖는 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 2'-메톡시 뉴클레오타이드가 아닌 정상적인 뉴클레오타이드를 사용한 샘플을 정상적인 뉴클레오타이드로 tDT 반응을 시킨 샘플을 비교하였다. 도 3C와 3D는 0.6U 엑소뉴클레아제와 0.1 pmol T7 오토진 카세트 (혹은 루시퍼라아제-생산 카세트)를 37 ℃에서 다양한 시간 동안 반응시킨 후 아가로스 전기영동을 한 결과이다. 도 4는 Rpol (=T7 오토진 카세트) 및 luc (=luc-생산 카세트)를 다양한 weight ratio로 섞고 HEK293T cell에 형질 감염한 후 시간별로 4 시간까지 bioluminescence signal을 측정한 결과이다. 도 5A와 5B는 T7 오토진 카세트 및 luciferase-생산 카세트를 0.1 μg씩 섞고 HEK293T cell에 형질 감염 한 후 RT_qPCR을 이용하여 T7 RNA 폴리머라아제의 유전자