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KR-20260060598-A - MARKER COMPOSITION FOR MEASURING TOXICITY TO UPPER MOTO NEURONS COMPRIGING GluN3

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Abstract

본 발명의 상위운동 신경세포 오가노이드를 포함하는 상위운동 신경세포에 대한 독성 측정용 마커 조성물을 이용하면 상위운동 신경세포에 대하여 독성이 있는 화합물을 정확하게 스크리닝할 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 독성 측정용 마커 조성물은 세포사멸 인자와 발현 패턴을 갖는 GluN3을 바이오 마커로 설정함에 따라 효과적인 독성 평가가 가능하다. 본 발명의 상위운동 신경세포 오가노이드로서 유도만능 줄기세포로부터 유래된 대뇌피질 상위운동 신경세포를 사용함에 따라 윤리적 문제없이 용이하게 생산할 수 있고, 다양한 생체 외 실험모델에 적용될 수 있다.

Inventors

  • 김종현
  • 김하은
  • 김보미

Assignees

  • 협성대학교산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241025

Claims (12)

  1. 상위운동 신경세포 오가노이드를 포함하는 상위운동 신경세포(upper motor neuron, UMN)에 대한 독성 측정용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드는 대뇌피질 상위운동 신경세포 오가노이드인 것을 특징으로 하는 독성 측정용 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드는 유도만능 줄기세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 독성 측정용 마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드가 독성 화합물에 노출 시 GluN3의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 독성 측정용 마커 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 GluN3이 GluN3A인 것을 특징으로 하는 독성 측정용 마커 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 GluN3는 신경모세포종(Neuroblastoma) 세포주에서는 발현되지 않고, 유도만능 줄기세포로부터 유래된 유사 대뇌피질 상위운동 신경세포 오가노이드 및 인체유래 대뇌피질 조직에서는 발현되는 것을 특징으로 하는 독성 측정용 마커 조성물.
  7. 독성에 노출되지 않은 상위운동 신경세포 오가노이드의 GluN3의 제1 mRNA 발현양을 측정하는 단계; 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물에 노출된 상위운동 신경세포 오가노이드의 GluN3의 제2 mRNA 발현양을 측정하는 단계; 및 제1 mRNA 발현양 대비 제2 mRNA 발현양의 비율이 1.5 이상인 경우 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 단계; 를 포함하는 상위운동 신경세포에 대한 독성 측정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물의 농도가 20 μM 이상인 것을 특징으로 하는 독성 측정 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 GluN3이 GluN3A인 것을 특징으로 하는 독성 측정 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 단계에서 제1 mRNA 발현양 대비 제2 mRNA 발현양의 비율이 4.0 이상인 경우 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 독성 측정 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물의 농도가 80 μM 이상인 것을 특징으로 하는 독성 측정 방법.
  12. 상위운동신경세포 오가노이드를 포함하는 상위운동 신경세포 독성 측정용 키트.

Description

상위운동신경세포 오가노이드를 포함하는 독성 측정용 마커 조성물{MARKER COMPOSITION FOR MEASURING TOXICITY TO UPPER MOTO NEURONS COMPRIGING GluN3} 본 발명은 상위운동 신경세포에 대한 독성 측정용 마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상위운동신경세포 오가노이드를 포함하고, GluN3를 바이오 마커로 사용하는 독성 측정용 마커 조성물에 관한 것이다. 우리 몸을 구성하는 신경계는 중추신경계(Central Nervous System, CNS)와 말초신경계(Peripheral Nervous System, PNS)로 구분되어 있다. 운동 신경세포(motor neuron)도 중추신경계를 구성하고 있는 상위운동신경세포(뇌피질에서 시작해 뇌줄기(brain stem)나 척수(spinal cord)까지 전달되는 전기적 신호)와 말초신경계를 구성하고 있는 하위운동신경세포(lower motor neuron, LMN, 척수에서 시작해 근육이나 샘들에 영향을 미치는 전기적 신호)로 구분되어 있으며, 이 두 운동세포의 협력은 수의운동(voluntary movement)의 중추적 역할을 한다. 관련하여 외부 신경자극 약물이 대뇌 피질을 구성하고 있는 상위운동신경세포에 미치는 독성의 지표에 대한 신규 인자를 찾는 것이 필요한 실정이다. 도 1은 이온성 글루탐산 수용체의 하위 유형과 구조를 나타내는 모식도이다. 도 2는 SK-N-SH, UMN 3D, Brain에서의 NMDAR 하위 유형인 GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluN3B의 발현을 나타낸다. 도 3은 약물 처리하지 않은 대조군을 포함하여 총 7 군의 약물 군에서의 P53, Casp 3, GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluN3B 발현 패턴을 나타낸다. 도 4는 아미프틸린의 농도를 20 μM 및 80 μM로 처리하면서 상기 지표들의 mRNA의 발현를 나타낸다. 도 5는 아미트리프틸린 농도에 따른 Caspase 9(Casp 9), Caspase 3(Casp 3), 절단된 Caspase 3, GAPDH에 대한 단백질 발현량을 나타낸다. 이하 첨부된 도면과 설명을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대한 원리를 상세히 설명한다. 다만, 하기에 도시되는 도면과 후술되는 설명은 본 발명의 특징을 효과적으로 설명하기 위한 여러 가지 방법 중에서 바람직한 실시 방법에 대한 것이며, 본 발명이 하기의 도면과 설명만으로 한정되는 것은 아니다. 한편, 제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설명된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함으로 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상 적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 본 발명의 발명자는 외부 신경자극 약물이 대뇌 피질을 구성하고 있는 상위운동신경세포에 미치는 독성의 지표로 신규 인자를 찾기 위하여 3가지 연구를 진행하여 결과를 도출하였다. 첫째로, 유도만능줄기세포로부터 유사 대뇌피질 상위운동신경세포 오가노이드를 형성하였으며, 둘째로 약물 독성평가를 실시 후 세포사멸사 (세포사멸 중요 경로 단백질p53, BAX, Cytochrome C, Caspase 3, 9 등) 기전 분석을 실시하였으며, 마지막으로 신규 독성 지표 확립을 위하여 상위운동신경세포를 구성하는 흥분성 신경세포의 세포막 수용체 중 하나인 이온성 글루탐산 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)의 하위 유형을 탐색하였다. 이온성 글루탐산 수용체는 총 7종의 GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluN3B 하위 유형으로 구성되어 있다. 이 중 GluN1과 GluN2는 기능성과 발생학적 의미성이 알려졌지만, GluN3는 아직까지 그 의미성이 많이 알려져 있지 않다. 도 1은 이온성 글루탐산 수용체의 하위 유형과 구조를 나타내는 모식도이다. 따라서 본 발명의 발명자는 앞서 확립된 상위운동신경세포 오가노이드의 약물 독성 평가와 기전 분석을 통하여 GluN3A가 새로운 독성평가 지표가 될 수 있다는 것을 확인하였다. 본 명세서에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 일 실시상태는 상위운동 신경세포 오가노이드를 포함하는 상위운동 신경세포에 대한 독성 측정용 마커 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드는 대뇌피질 상위운동 신경세포 오가노이드일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드는 유도만능 줄기세포로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 상위운동 신경세포 오가노이드가 독성 화합물에 노출 시 GluN3의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 GluN3이 GluN3A일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 GluN3는 신경모세포종 세포주에서는 발현되지 않고, 유도만능 줄기세포로부터 유래된 유사 대뇌피질 상위운동 신경세포 오가노이드 및 인체유래 대뇌피질 조직에서는 발현되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태는 독성에 노출되지 않은 상위운동 신경세포 오가노이드의 GluN3의 제1 mRNA 발현양을 측정하는 단계; 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물에 노출된 상위운동 신경세포 오가노이드의 GluN3의 제2 mRNA 발현양을 측정하는 단계; 및 제1 mRNA 발현양 대비 제2 mRNA 발현양의 비율이 1.5 이상인 경우 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 상위운동 신경세포에 대한 독성 측정 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물의 농도가 20 μM 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물의 농도가 80 μM 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물의 농도는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 μM 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 단계에서 기준이 되는 제1 mRNA 발현양 대비 제2 mRNA 발현양의 비율은 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 또는 4.5일 수 있다. 상기 독성이 있는 것으로 의심되는 화합물이 독성이 있는 것으로 판단하는 단계에서 기준이 되는 제1 mRNA 발현양은 제2 mRNA 발현양보다 적을 수 있다. 본 발명의 일 실시상태는 상위운동신경세포 오가노이드를 포함하는 상위운동 신경세포 독성 측정용 키트를 제공하는 것이다. 이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 제조예 1. 유사 대뇌피질 상위운동신경세포 오가노이드 제조 유도만능줄기세포로부터 유사 대뇌피질 상위운동신경세포 오가노이드를 형성하였다. 3차원 세포집단에 약물을 처리하여 줄기세포가 가진 자기조직화 과정을 유도하는 방식으로 제조하였다. Knoblich 그룹의 제조 방법을 사용하였으며 3D 신경상피 회전타원체를 매트리젤에 임베디드시킨후 저산소 및 스피닝 환경에서 제작하였다. 실시예 1. 유사 대뇌피질 상위운동신경세포 오가노이드의 형성 확인 SK-N-SH(신경모세포종(Neuroblastoma) 세포주), UMN 3D(본 발명의 오가노이드), 인체유래 대뇌피질 조직(서울대병원에서 분양받음, 도 2에서 Brain으로 표기)에서 NMDAR 하위 유형(subtype)의 발현을 확인하였다. 도 2는 SK-N-SH, UMN 3D, Brain에서의 NMDAR 하위 유형인 GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2C, GluN2D, GluN3A, GluN3B의 발현을 나타낸다. 인체유래 대뇌피질 조직(Brain) 기준으로 NMDAR 하위 유형의 발현을 분석한 결과 신경모세포종 세포주인 SK-N-SH에서는 GluN2B와 GluN3A이 발현되지 않는 반면 UMN 3D과 Brain에서는 모두 잘 발현되는 것을 확인하였다. 실시예 2. 약물 독성평가를 실시 후 세포사멸사 기전 분석 UMN 3D 세포에 아스피린(Aspirin, ASP) 10 μM, AMI 8