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KR-20260060648-A - Methods of Mechanical Functional Analysis of P-Glycoprotein Using In Silico Molecular Modeling

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Abstract

P-글리코단백질(P-gp)은 막에 널리 발현되는 다중 약물 수송체이며, P-gp 기질의 약동학적 다양성이 P-gp를 인코딩하는 ABCB1 다형성에 크게 의존하는지 여부는 불분명합니다. 본 출원 발명에서는 실리코 분자 모델링을 통해 P-gp의 기전적 기능을 분석하고, ABCB1 다형성에 따른 약동학적 차이의 존재여부를 확인하는 것입니다. 본 출원 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여, 실리코 분자 모델링 방법에 있어서, P-gp의 뉴클레오타이드 서열과 1차원 아미노산 서열 정보를 기반으로 단백질을 구조화하는 단계(S-1); 및 리간드 화합물 구조의 생성 및 화학 및 구조 공식을 기반으로 한 입체 배열 수정단계를 포함한 리간드 화합물 구조화단계(S-2); 및 구조화된 상기 단백질에서 리간드 도킹 사이트 검색은 키 및 잠금 원리, 정성 및 정량 도킹 분석(CDOCKER)을 사용하는 단백질 구조의 리간드 도킹 사이트 검색(S-3); 및 상기 구조화된 단백질의 다형성 수용체에 동일한 리간드를 도킹한 후 실리코 수준에서 유전적 다향성의 영향을 분석하는 유전적 다형성 영향 분석단계(S-4)를 포함하는 실리코 분자 모델링 방법을 제공한다. 상기와 같은 발명의 구성에 의하여 다음 단백질 3차 구조 재접힘 및 최적화를 통해 다형성 P-gp 분자 구조를 확립할 수 있었고, P-pg의 아포 상태, 리간드 도킹 상태 및 바깥쪽 상태에 대한 893개 지점 다형성을 확립하는 효과가 있는 기술을 제공한다.

Inventors

  • 정승현

Assignees

  • 국립순천대학교산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241025

Claims (4)

  1. 실리코 분자 모델링 방법에 있어서, P-gp의 뉴클레오타이드 서열과 1차원 아미노산 서열 정보를 기반으로 단백질을 구조화하는 단계(S-1); 및 리간드 화합물 구조의 생성 및 화학 및 구조 공식을 기반으로 한 입체 배열 수정단계를 포함한 리간드 화합물 구조화단계(S-2); 및 구조화된 상기 단백질에서 리간드 도킹 사이트 검색은 키 및 잠금 원리, 정성 및 정량 도킹 분석(CDOCKER)을 사용하는 단백질 구조의 리간드 도킹 사이트 검색(S-3); 및 상기 구조화된 단백질의 다형성 수용체에 동일한 리간드를 도킹한 후 실리코 수준에서 유전적 다향성의 영향을 분석하는 유전적 다형성 영향 분석단계(S-4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리코 분자 모델링 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 P-gp의 아미노산 서열 및 구조정보는 RCSB 단백질 데이터뱅크의 극저온 전자현미경 이미징 결과를 이용하는 것을 특징으로 하는 실리코 분자 모델링 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리간드 화압물의 구조정보는 상기 PubChem의 데이터베이스를 이용하는 것을 특징으로 하는 실리코 분자 모델링 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 P-gp 및 상기 리간드 화합물은 3차원으로 구조화된 것을 특징으로 하는 실리코 분자 모델링 방법.

Description

실리코 분자 모델링을 이용한 P-글리코단백질 기계적 기능 분석방법{Methods of Mechanical Functional Analysis of P-Glycoprotein Using In Silico Molecular Modeling} 본 출원 발명은 실리코 분자 모델링을 통해 P-gp의 기전적 기능을 분석하고자 하는 것이다. 더욱 자세하게는 ABCB1 다형성에 따른 약동학적 차이를 분석하는 방법을 제공하고자 하는 것이다. 본 발명의 출원 이전의 선행기술로 인간 피부 활성제의 인실리코 테스트 방법 및 시스템에 관한 기술이 개시되어 있다. 이 기술은 분자 동역학 시뮬레이션(molecular dynamics simulations) 및 전산 유체 동역학 접근법(computational fluid dynamics approach)을 사용하여 개발된 피부 모델을 통해, 약물, 입자(particles) 및 화장품과 같은 다양한 활성제의 확산 및 방출 프로파일(diffusion and release profile)을 계산하기 위한, 다중 스케일 모델링 프레임워크(multi-scale modeling framework)의 구성을 개시하고 있다. 또 다른 선생기술로 인간 피부에서 활성 분자를 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ 시험하기 위한 방법 및 시스템이 개시되어 있다. 이 기술의 피부 상부 보호층인 각질층의 마이크로적 및 매크로적 레벨 모델은 분자동력학 시뮬레이션 및 계산 유체 역학 수법을 이용하고, 구축된 피부 모델을 통해, 의약품, 입자, 및 화장품과 같이 다른 활성 분자의 확산 및 방출 프로필을 계산하기 위한 멀티스케일 모델링 체제를 구성요소로 하고 있다. 도 1은 본 발명의 분자 모델링 연구 워크플로의 개략도이다. 도 2는 본 발명의 3차원 구조 분자 모델링의 비교 연구를 통해 제안된 에너지 흐름 P-글리코단백질(P-gp)의 메커니즘을 도시하고 있다. 도 3은 본 발명의 P-글리코단백질(P-gp) 약물 결합 포켓(DBP)에 도킹된 펙소페나딘의 3차원 도면이다. 도 4는 본 발명의 Ala893Ser(왼쪽)과 Ala893Thr(오른쪽)의 점 다형성 구조 비교도면이다. 도 5는 본 발명의 ABCB1 c.2677G > A에 따른 893 (A) Ala 및 (B) Thr 주변의 잠재적 리간드 결합 부위에 대한 검색 결과이다. 도 6은 (A) 외향 상태 P-글리코단백질(P-gp)에 대한 Ala893Ser/Thr 다형성과 (B) 뉴클레오타이드 결합 도메인(NBD)에서 아데노신 삼인산(ATP) 상호작용에 따른 3차원 분자 구조 분석 도면이다. 도 7은 본 발명의 (A) Ala893Ser/Thr에서의 국소 α-나선 구조, 비틀림 및 안정성 분석과 (B) 893 Ala, Ser 및 Thr을 중심으로 한 P-당단백질 구조에서 상호작용하는 잔류물 및 결합 유형의 2차원 도면이다. 본 출원 발명의 작용효과를 도면을 활용하여 설명하면 다음과 같다. 1. 개요 P-글리코단백질(P-gp)은 항암제를 포함한 약물 내성과 관련된 12개의 나선형 구조를 가진 막 수용체이다. P-gp는 아데노신 삼인산(ATP) 결합이 필요한 에너지 의존성 단백질이다. P-gp와 약물 내성은 1970년대부터 보고되었지만, 그 구조와 작용 기전은 모르는 것이 아직 많이 있다. 이는 막 단백질 수용체의 구조적 역학에 대한 연구가 크라이오 스캐닝 장비와 표적 분자 추출을 사용하는 기존의 복잡한 실험적 접근 방식 때문에 발생하는 장벽을 해결하지 못하였기 때문이다. ABCB1은 P-gp 발현 정보를 인코딩합니다. ABCB1의 다형성은 P-gp 발현 및/또는 기능에 영향을 미쳐 개인 간 P-gp 기질 약물의 약동학적 변동성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. P-gp는 장 상피, 신장, 간, 혈액-뇌 장벽, 자궁 및 태반 세포를 포함한 거의 모든 정상 세포에서 발현되며 여러 기질 약물의 흡수, 분포 및 배설에 영향을 미칠 수 있다. ABCB1 유전자는 다형성이 매우 강하여 1200개 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이 확인되었다. ABCB1 c.1236C > T, c.2677G > T/A 및 c.3435C > T가 가장 자주 발생하는 SNP이며 개인 간 약동학적 변동성을 설명하는 잠재적 공변량으로 연구되었습니다. ABCB1 c.1236C > T 및 c.3435C > T는 침묵 다형성에 해당하고, c.2677G > T/A는 893 Ala가 Ser 또는 Thr로 대체되는 미스센스 다형성에 해당한다. ABCB1 c.1236C > T, c.2677G > T/A 및 c.3435C > T 유전적 다형성에 따른 P-gp 기질 약물의 약동학적 다양성은 논란의 여지가 있다. 이전 연구에 따르면 P-gp의 다형성 효과는 ABCB1 유전자의 주요 다형성인 c.1236C > T, c.2677G > T, c.3435C > T에 따른 난자 발현 시스템을 사용하여 확인되었다. 그러나 P-gp 기질인 디곡신과 이마티닙의 수송 수준에서 유전적 다형성 간에는 유의한 차이가 없었다. 이 논문은 ABCB1의 c.1236C > T, c.2677G > T, c.3435C > T 다형성이 시험관 내 실험 결과에 근거하여 P-pg 기능에 영향을 미치지 않을 것이라고 결론지었다. 동일한 P-gp 기질 약물에 대해 일부 보고서는 ABCB1 유전적 다형성에 따른 약동학의 차이를 확인했지만 다른 보고서는 유의한 차이를 확인하지 못했으며, 또 다른 보고서에서는 ABCB1 c.3435C > T가 펙소페나딘의 개인 간 약동학적 변동성과 유의하게 연관되지 않는다는 것을 확인했다. 또 다른 보고서에서는 ABCB1 c.2677G > T/A와 c.3435C > T에 따라 개인 간 펙소페나딘의 약동학적 변동성을 확인했다. 그러나 곡선 아래 면적(AUC, 혈장 농도-시간 프로필)은 ABCB1 c.2677AA/3435CC에서 17% 낮았고 ABCB1 c.2677TT/3435TT에서 ABCB1 c.2677GG/3435CC보다 47% 높았다. 즉, ABCB1 유전자 야생형에서 다형성 요소가 증가함에 따라 수송체 기능이 꾸준히 증가하거나 감소하지 않았다. 또 다른 강력한 P-gp 기질인 베라파밀은 논란의 여지가 있는 ABCB1 c.2677GG/3435CC에서 ABCB1 c.2677GT/ 3435CT 및 c.2677TT/3435TT로의 AUC 감소를 보였는데, 이는 펙소페나딘의 결과와 상반되었다. 또한, 알려진 P-gp 기질인 사이클로스포린, 디곡신 및 타크롤리무스에서 ABCB1 c.1236C > T, c.2677G > T/A 및 c.3435C > T 다형성에 따라 개인 간 약동학적 변동성은 확인되지 않았다. 그러나 유전적 다형성의 영향에 대한 이러한 보고서의 대부분은 후향적 데이터 분석을 포함했으며 표적 유전자 이외의 유전자의 잠재적 영향을 고려하지 않았다. 본 출원 발명에서는 기존 ABCB1 유전적 다형성 인자에 의한 약동학적 다양성 효과는 거의 무시할 수 있는 반면, 다른 인자에 의한 약동학적 다양성 효과는 본질적으로 존재한다고 가설을 세웠다. 본 출원발명에서는 ABCB1 다형성(특히 c.2677G > T/A)에 따른 P-gp 기질 약물의 약동학적 다양성을 밝히기 위해 분자 구조 모델링 접근법을 사용했다. 이는 P-gp의 분자 구조 정보가 다형성에 따른 작용 기전을 설명할 수 있고 거시적인 생체 내 다형성 현상을 합리적으로 설명하는 데 유용한 다리 역할을 할 것이기 때문이다. 과거에 보고된 P-gp의 실험적 구조 정보를 기반으로 한 실리코 분자 모델링과 통합 메커니즘 해석을 통한 유전적 다형성 요인의 영향 분석은 본 출원발명에서 효과적인 접근 도구로 간주되었다. 실리코 모델링은 현실에 매우 가까운 조건과 정보를 기반으로 하며 기존 실험적 접근 방식에 비해 다양한 요인을 동시에 효율적으로 확인하고 의미 있는 구조 정보를 도출할 수 있기 때문이다. 또한 ABCB1 유전자 다형성에 따른 개인 간 약동학의 다양성에 대한 논란이 계속되고 있는 펙소페나딘은 본 출원발명에서 제안된 P-gp의 기계적 작용을 적용하기 위한 모범적인 약물로 설정되었다. 본 출원 발명은 in silico 분자 모델링을 통해 P-pg의 기전적 기능을 탐구하고 약동학 다양성에서 ABCB1 유전자 다형성의 관련성에 대한 논란을 해결하는 것을 하나의 목표로 하고 있다. ABCB1 c.2677G > T/ A에 대한 분자 모델링을 포함하는 구조적 활동 연구가 시도되었다. c.1236C > T 및 c.3435C > T는 구조적 변화에 영향을 미치지 않았기 때문에 분자 모델링 연구에 적합하지 않았지만 발현 수준의 연구는 가능했다. 그러나 이전 보고에 따르면 ABCB1 c.1236C > T 및 c.3435C > T에 의한 유전적 다형성의 영향은 생체 내 수준에서 미미하였다. 이는 ABCB1 c.2677G > T/A 외에도 c.1236C > T 및 c.3435C > T도 P-gp 매개 약동학적 변동성에서 매우 논란의 여지가 있는 요인임을 의미한다. 본 출원 발명은 실리코 모델링을 통해 기전적 해석과 관련하여 개인 간 생체 내 약물 동태적 변동성(수송체 기질 약물)을 설명하는 데 사용된 새로운 접근 방식이다. 부언하면, 유전적 다형성에 따른 생물학적으로 발현된 수송체의 구조적 변화 평가와 그로부터 기질 약물과의 상호작용 예측은 기존의 일반적인 현상학적 약동학적 다양성 해석 연구에서 시도되지 않았던 새롭고 중요한 접근 방식이다. 본 출원 발명에서 소개된 분자 모델링 방법과 결과의 해석은 개인 간 약동학적 변동성에 영향을 미칠 핵심 후보 분자의 기전적 분석을 위한 매우 유용한 플랫폼 접근 방식으로 사용될 것으로 기대된다. 2. 실험방법 1. 본 출원 발명의 실리코 분자 모델링 연구는 세 단계로 구성되었습니다. 첫 번째 단계는 3차원 단백질 구조를 생성하고 리간드 화합물을 구조화하는 것이다. 단백질 구조화는 P-gp의 뉴클레오타이드 서열과 1차원 아미노산 서열 정보를 기반으로 단백질 세척 및 준비(생략된 아미노산 및/또는 구조 정보 추가)를 통해 수행되었습니다. 리간드 구조화에는 구조 생성 및 수정 단계(화학 및 구조 공식을 기반으로 한 입체 배열)가 포함되었다. 두 번째 단계에서는 키 및 잠금 원리, 정성 및 정량 도킹 분석(CDOCKER)을 사용하여 준비된 단백질에서 리간드 도킹