KR-20260060805-A - CULTURE MEDIUM COMPOSITION FOR IN VITRO MATURATION OF OOCYTE CONTAINING PIPERINE AND METHOD USING THEREOF

Abstract

본 발명은 피페린을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배아 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 피페린을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양 배지 조성물은 활성 산소종 억제를 통해 난자를 질적으로 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 배지에서 성숙된 체외 성숙 난자를 이용하면 체외 배아 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

Inventors

• 박세필
• 김은영
• 이승은
• 박민지
• 임은서

Assignees

• 제주대학교 산학협력단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20241025

Claims (8)

1. 피페린(piperine)을 유효성분으로 포함하는, 난자 체외 성숙용 배양 배지 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 난자는 포유동물의 난자인 배양 배지 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 배양 배지 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 피페린은 150 내지 300 μM 의 농도로 포함하는 배양 배지 조성물.
5. 난자를 준비하는 단계; 피페린이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 상기 난자를 체외성숙 시키는 단계; 상기 체외성숙된 난자의 단위발생을 유도하는 단계; 상기 단위발생이 유도된 난자를 활성화시키는 단계; 상기 활성화된 난자에 체세포핵이식을 실시하는 단계; 및 상기 체세포핵이식된 난자를 배양하는 단계; 를 포함하는, 체외 배아 생산방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 난자는 포유동물의 난자인, 체외 배아 생산방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인, 체외 배아 생산방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 피페린은 150 내지 300 μM의 농도로 포함되는, 체외 배아 생산방법.

Description

피페린을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법{CULTURE MEDIUM COMPOSITION FOR IN VITRO MATURATION OF OOCYTE CONTAINING PIPERINE AND METHOD USING THEREOF} 본 발명은 피페린을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법에 관한 것이다. 난자의 체외 생산은 배아의 발생을 다루는 모든 실험의 가장 기본이 되는 단계로, 실험실에서 체내의 조건과 유사한 환경을 조성하여 목적에 따른 실험을 실시하게 된다. 따라서, 체내 환경을 실험실 환경에서 얼마나 유사하게 재현할 수 있는지 여부는 난자를 다루는 것에 있어 매우 중요하다. 일반적으로 난자의 체외 생산은 난자의 성숙 시기와 배아의 발달 시기로 나눌 수 있다. 성숙이 끝난 난자는 2n상태의 핵상을 가지게 되는데, 이는 제 2차 감수분열 중기의 상태가 되는 것을 의미한다. 세포질 성숙 단계에서는 세포 소기관의 재배치, 세포골격 운동, 분자성숙이 일어난다. 세포질 성숙은 후기배아 발달을 결정짓는 중요한 과정이므로, 체외성숙(In vitro maturation, IVM)은 다음 단계의 실험에 지대한 영향을 미치는 기초적이고 핵심적인 단계라고 할 수 있다. 체외배양(In vitro culture)은 체내배양(In vivo culture)에 비해 효율이 현저히 낮기 때문에 많은 연구자들에 의해 돼지난자의 체외성숙 조건을 개선하고자 하는 연구가 계속 진행되고 있다. 미성숙 난자를 체외에서 성숙시키는 것은 이후 난자와 배아의 발달에 큰 영향을 미친다. 온도, 대기 및 배지의 조성 등 외부 조건들은 난자와 배아의 미토콘드리아 기능, 세포골격 발달 및 기타 소기관의 기능에 영향을 미치고, 이후 난자와 배아의 성숙 및 발달 단계에 현저한 차이가 나타날 수 있다. 이러한 이유로 세포, 난자 및 배아 등 다양한 범위에서 활성산소와 발달의 연관관계를 밝히기 위한 실험들이 진행되고 있다. 세포 내에서 증가된 외부 유래 산소 농도는 난자의 체외 성숙에 큰 영향을 미치기 때문에 난자의 발달 효율이 감소하게 된다. 또한, 난자의 체외 성숙 동안 발생하는 에너지원의 불균형은 난자에서 전사된 유전자의 메틸화에 원인이 된다. 전사는 태반의 기능과 태아 성장의 조절에서 중요한 역할을 하고, 난자의 성장 동안 전사의 개시와 유지는 초기 배아적 손상에 영향을 줄 수 있으며, 체외 또는 체내 성숙 조건의 변화, 호르몬의 첨가 여부, 및 다양한 호르몬에 대한 노출 빈도는 제 2 감수분열 중기 미세섬유의 형태형성에 상당한 영향을 미친다. 따라서, 세포 내 환경과 세포, 난자, 그리고 배아의 체내 발달 능력을 개선할 수 있는 기술 개발이 요구된다. 피페린(piperine, PIP)은 항산화, 항염증, 항암, 항비만 등 다양한 생리적 효과를 가지고 있다. 인슐린과 렙틴 감수성을 개선하여 비만 조절에 기여하고, 세포주기의 G2/M 단계에서 암세포를 억제하여 세포 독성을 나타내기도 한다. 이러한 PIP가 배아 발달 능력에 기여한다는 연구 논문은 보고된 바 없다. 도 1은 다양한 농도의 PIP로 돼지 난모세포를 처리한 것이 이후의 체외 배아 발달에 미치는 영향을 나타낸 것이다[(A) PB 압출, 분열 및 BL의 형태. 스케일 바, 100 μm. (B) PB 압출, 분열 및 BL 형성 속도. (C) 배반포 염색. 스케일 바, 160 μm. (D) BL당 총 세포 수. (E) BL에서 세포 사멸 세포의 백분율은 7일째에 분석되었다. 데이터는 4회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(*p < 0.05)]. 도 2는 IVM 중 돼지 난모세포에 대한 PIP의 항산화 효과를 확인한 것이다[(A) DCFHDA(녹색, a-b, ROS 염색) 및 CMF2HC(파란색, c-d, GSH 염색)로 염색된 난모세포의 대표 이미지. 스케일 바, 100 μm. (B) DCFHDA 및 CMF2HC의 형광 강도의 정량화. 난모세포는 MII 단계에서 분석하였다. 실험은 실험당 10개의 난모세포를 사용하여 6회 반복하였다. (C) 항산화 유전자(Nr/2, CAT, HO-I, SODI 및 SOD2)의 상대적 발현]. 데이터는 6회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(*p < 0.05)]. 도 3은 PIP가 시험관 내 돼지 난모세포의 염색체 정렬 및 스핀들 조직에 미치는 영향을 나타낸 것이다[(A) 정상 및 비정상 형태를 가진 난모세포의 대표 이미지. 스케일 바, 50 μm. (B) 정상적인 염색체 정렬과 스핀들 형태를 가진 난모세포의 비율. 난모세포는 MII 단계에서 분석되었다. 데이터는 6회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(**p < 0.01).] 도 4는 PIP가 시험관 내 돼지 난모세포의 세포질 성숙에 미치는 영향을 나타낸 것이다[(A) 총 및 인산화된 p44/42 MAPK의 웨스턴 블롯 분석. (B) 포스포-p44/42 MAPK와 p44/42 MAPK의 비율. 난모세포는 MII 단계에서 분석하였다. 데이터는 6회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(***p < 0.001)]. 도 5는 돼지 난모세포의 IVM 중 PIP 처리가 이들 난모세포에서 유래된 배아의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다[다능성 관련(CDX2, NANOG, POU5Fl 및 SOX2), 항아포토시스(BCL2Ll 및 BIRC5), 친아포토시스(BAK, FAS 및 CASP3) 유전자의 상대적 발현. 데이터는 6회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001)]. 도 6은 돼지 난모세포의 IVM 중 PIP 처리가 SCNT를 통해 이들 난모세포에서 유래된 BL에 미치는 영향을 나타낸 것이다[(A) SCNT를 통한 난모세포의 대표 이미지. 스케일 바, 100 μm. (B) 융합, 분열 및 BL 형성 속도. (C) 배반포 염색. 눈금 막대, 160 μm. (D) BL당 총 세포 수. (E) BL에서 세포사멸 세포의 백분율. BL은 7일째에 분석하였다. 데이터는 4회 반복 실험에서 얻은 평균 ± SEM이다(*p <0.05).] 이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 참조예:　약어 ART assisted reproductive technology 보조 생식 기술 BAK Bcl-2 antagonist/killer 길항제/킬러 BCL2L1 BCI.2-like 1 BCI.2 유사 1 BIRCS baculoviral IAP repeat-containing 5 바큘로바이러스 IAP 반복 함유 5 BL blastocyst 배반포 BSA bovine serum albumin 소 혈청 알부민 CASP3 cysteine-aspartic acid protease 3 시스테인-아스파르트산 프로테아제 3 CAT 카탈라아제 CDX2 caudal type homeobox protein 2 꼬리형 호모박스 단백질 2 CMF2HC: 4-chloromethyl~,S-difluoro-7-hydroxycoum.arin 클로로메틸~,S-디플루오로-7-하이드록시쿠엠.아린 COC cumulus-oocyte complex 적운-난모세포 복합체 DCFHDA dichlorohydrofluorescein diacetate 디클로로하이드로플루오레세인 디아세테이트 DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline 둘베코의 인산염 완충 식염수 FAS Fas cell surface death receptor 파스 세포 표면 사멸 수용체 GSH glutathione 글루타치온 H0-1 heme o.xygenase 1 헴오시게나제 1 IVM in vitro maturation 체외 성숙 MAPK mitogen-activat:ed protein kinase 미토겐 활성화 단백질 키나제 MII metaphase II 중기 II NANOG Nanog homeobox Nanog 호메오박스 Nrf2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 PB polar body 극체 POUSF1 POU domain, class 5, transcription factor 1 POU 도메인, 클래스 5, 전사 인자 1 PZM porcine zygote medium 돼지 접합자 배지 ROS reactive oxygen species 반응성 산소종 SCNT somatic cell nuclear transfer 체세포 핵 이식 SDS sodium dodecyl sulfate 도데실황산나트륨 SOD1 superoxide dismutase 1 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 SOD2 superoxide dismutase 2 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2 SOX2 sex-determining region Y-box transcription factor 2 성 결정 영역 Y-박스 전사 인자 2 TCM tissue culture medium 조직 배양 배지 실시예 [재료 및 방법] 1. 화학물질 및 시약 모든 화학물질과 시약은 달리 명시되지 않는 한 시그마(미주리주 세인트루이스)에서 구입하였다. 2. 난모세포 수집 및 IVM 사춘기 전 돼지 난소를 현지 도축장에서 채취하여 2시간 이내에 실험실로 운반하였고, 운반하는 동안 75 μg/mL 페니실린 G와 50 μg/mL 스트렙토마이신 설페이트를 함유한 식염수에 담가 30~33℃에서 유지하였다. COC를 직경 2~8mm의 난포에서 흡인하였다. 0.1%(w/v) BSA를 함유한 조직 배양 배지(TCM)-199-HEPES에서 COC를 세 번 세척하였다. 그 후, 그룹당 50개의 COC에 Earle's 2염, 시스테인 0.57mM, 표피 성장 인자 10ng/mL, 난포 자극 호르몬 0.5μg/mL, 황체 형성 호르몬 0.5μg/mL, 돼지 여포액 10%(v/v)를 처리하였다. 성숙은 38.8℃에서 5% C02와 95% 공기의 분위기에서 44시간 동안 미네랄 오일을 사용하여 수행하였다. IVM 동안 배지에 O, 50, 100, 200 또는 400 μM PIP를 보충하였다. 각 그룹에