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KR-20260061024-A - FGF-BoNT fusion protein in which FGF protein and BoNT protein are fused and cosmetic composition containing the same

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Abstract

본 발명은 FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 신경세포의 수용체와 결합하는 Hc 도메인을 제거하고 FGF를 융합한 결과, FGF와 BoNT를 동시에 피부에 전달할 뿐만 아니라 BoNT의 신경 독소로서의 기능이 제거되고 피부 세포에 표적 전달되는 효과를 얻을 수 있는데, 이로부터 안전하고 효과적인 피부 개선 기능성 화장품의 원료가 될 수 있다.

Inventors

  • 이치호
  • 유석현
  • 김병희
  • 박송
  • 조기준
  • 정상원

Assignees

  • 엠브릭스 주식회사

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20251021
Priority Date
20241024

Claims (12)

  1. FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자가 결합된 폴리뉴클레오타이드로써, 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 그 기능을 발휘하지 못하도록 변형되거나, 제외된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 제외된 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, LC 도메인을 암호화하는 유전자와 Hn을 암호화하는 유전자가 결합되어 형성된 것임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자는, 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자의 5'-말단에 결합되거나, 3'-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는 핵산 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 링커는, 펩타이드로 발현시, 단백질가수분해효소에 의해 절단될 수 있는 펩타이드를 암호화하거나, 단백질가수분해효소에 의해 절단되지 않는 펩타이드를 암호화하는 것임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자가 결합된 폴리뉴클레오타이드를 대장균에 도입하여 발현시키되, 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 그 기능을 발휘하지 못하도록 변형되거나, 제외된 것을 특징으로 하는 FGF-BoNT 융합단백질의 생산방법.
  7. FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질로써, 상기 BoNT 단백질은, Hc 도메인 활성이 소실되거나 Hc 도메인이 제거된 것을 특징으로 하는 FGF-BoNT 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Hc 도메인이 제거된 BoNT 단백질은, LC 도메인 및 Hn 도메인이 결합되어 형성된 것을 특징으로 하는 FGF-BoNT 융합단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 FGF 단백질은, 상기 BoNT 단백질의 N-말단에 결합되거나, C-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 FGF 단백질과 상기 BoNT 단백질은, 펩타이드 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는, 단백질가수분해효소에 의해 절단될 수 있는 펩타이드이거나, 단백질가수분해효소에 의해 절단되지 않는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  12. FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질를 함유하는 화장료 조성물로써, 상기 BoNT 단백질은, Hc 도메인 활성이 소실되거나 Hc 도메인이 제거된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

Description

FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {FGF-BoNT fusion protein in which FGF protein and BoNT protein are fused and cosmetic composition containing the same} 본 발명은 FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 BoNT에서 신경세포의 수용체와 결합하는 Hc 도메인을 제거하고 FGF를 융합함으로써, FGFR을 수용체로 하여 FGF와 BoNT를 동시에 피부에 전달할 뿐만 아니라 BoNT의 신경 독소로서의 기능이 제거되고 피부 세포에 표적 전달되는 효과를 얻을 수 있는 FGF-BoNT 융합단백질 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다. Fibroblast growth factor (FGF, 섬유아세포 성장인자)는 일종의 세포신호전달 단백질로서 세포의 성장 밀 발달을 조절하는 역할을 한다 (도 1). 현재까지 23 종의 FGF가 밝혀져 있으며, 세포막 표면에 있는 다양한 종류의 fibroblast growth factor receptor (FGFR)에 결합하여 여러 가지 세포내 신호를 전달하는 역할을 한다. FGF가 비활성화 상태의 FGFR에 결합하면 FGFR은 구조적 변화를 통해 dimer를 이루며, FGFR의 세포 내 위치 tyrosine kinase 도메인이 인산화되어 신호를 전달하게 된다. FGF는 fibroblast나 keratinocyte를 자극하여 collagen과 elastin을 생산하게 하며, 이로 인해 피부 노화를 개선하는 효과를 보인다. 최근에는 피부 노화를 방지하고 피부 세포를 건강하게 하기 위하여 EGF나 IGF 등과 함께 FGF를 포함하는 화장품들이 출시 되었다. 한편, 보툴리눔 톡신 (Botulinum neurotoxin, BoNT)은 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)이 생산하는 단백질로 가장 강력한 독소 중의 하나로 알려져 있다. BoNT는 A 부터 G까지 7 개의 혈정형 (serotype)이 있으며 그 안에 약 40 여개의 아형 (subtype)이 보고 되어 있다. BoNT는 150kDa의 polypeptide chain으로 발현되며 cleavage에 의해 50kDa의 light chain (LC)와 100kDa의 heavy chain(HC)으로 나뉘고, light chain과 heavy chain은 한 쌍의 disulfide bond에 의해 결합되어 있다 (도 2). HC (heavy chain)은 Hn (translocation domain, 전위 도메인)과 Hc(receptor binding domain, 수용체 결합 도메인)의 두 개의 도메인으로 이루어져 있으며, Hc 도메인은 숙주의 신경세포 표면에 있는 polysialogaglioside (PSG)와 Syt 또는 SV2와 같은 synaptic vesicle의 수용체 단백질에 동시 결합함으로써 BoNT가 신경세포의 synaptic vesicle로 들어갈 수 있도록 한다. 이후, synaptic vesicle의 pH가 낮아짐으로 인해 Hn가 구조적 변형을 일으키고, LC가 synaptic vesicle의 막을 통과하여 세포질로 들어갈 수 있도록 한다. LC(light chain)는 일종의 protease로서 신경전달물질을 저장하고 있는 vesicle의 membrane fusion을 일으키는 SNAP25나 syntaxin 또는 VAMP 같은 단백질을 절단하여 기능을 하지 못하도록 만든다. 결과적으로 신경전달물질이 분비되어 인접한 신경세포나 근육에 전달되는 것을 막아서 신경 또는 근육을 마비시키는 독소로서 작용하게 된다. 이러한 원리를 이용하여 BoNT는 눈꺼풀 경련이나 주름살 개선 등 다양한 치료제 또는 미용 분야에 응용되고 있다. 특히, BoNT를 이용한 미용시장은 계속 성장세에 있으며 여러 회사에서 BoNT를 이용한 미용 제품들을 개발하고 있다. 기존에는 클로스트리디움 보툴리눔에서 발현된 BoNT를 정제하는 방식으로 제품을 생산하였는데, 이렇게 생산된 보툴리눔은 여러가지 부속 단백질과 결합된 상태로, 약 900kDa에 이르며 부속 단백질에 의해 내성을 유발할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 도 1은 FGF 및 FGFR의 작용 기작을 보여준다. FGF가 FGFR에 결합 후 dimerization 및 인산화를 유도하여 세포내 신호를 전달한다. 도 2는 BoNT의 구조를 보여준다. LC (cataylytic domain), Hn (translocation domain), Hc (receptor binding domain)으로 이루어져 있다. 도 3은 FGF와 BoNT가 결합될 수 있는 다양한 구축물 (construct) 디자인의 예시를 보여준다. 도 4는 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006) 생산 결과를 보여준다. 도 5는 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 마우스 독성 실험 결과이다. 도 6은 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 피부세포 독성 실험 결과이다. 도 7은 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 피부개선 효과로써, 콜라겐 생성을 확인한 결과이다. 도 8은 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 피부개선 효과로써, TGF-β 증가를 확인한 결과이다. 도 9는 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 피부개선 효과로써, IL-1b 감소를 확인한 결과이다. 도 10은 본 발명에서 제조한 FGF-BoNT 융합단백질 (LCHn-FGF, MBT006)의 피부개선 효과로써, 상처 치유 효과를 확인한 결과이다. 본 발명은 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자가 결합된 폴리뉴클레오타이드로써, 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 그 기능을 발휘하지 못하도록 변형되거나, 제외된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)는, LC, Hn, Hc의 3가지 도메인으로 구성되는데, 본 발명에서는 Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 제외된 형태는, LC와 Hn 만으로 구성된 것을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자는, 바람직하게 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자의 5'-말단에 결합되거나, 3'-말단에 결합되는 것일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, 바람직하게 핵산 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 것일 수 있다. 이때, 상기 핵산 링커는, 펩타이드로 발현시, 바람직하게 단백질가수분해효소에 의해 절단될 수 있는 펩타이드를 암호화하거나, 단백질가수분해효소에 의해 절단되지 않는 펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다. 즉, 상기 핵산 링커는 단백질가수분해효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 가지고 있거나, 절단될 수 있는 서열을 가지고 있지 않을 수 있는 것이다. FGF와 BoNT는 그 시너지 효과를 극대화하기 여러 가지 형태로 디자인할 수 있는데, FGF와 BoNT가 하나의 polypeptide 사슬로 발현될 수 있도록 유전자 수준에서 융합한 형태로 다양한 조건에 맞게 디자인할 수 있다 (도 3). 이때, 추가적인 기능 향상을 위해 돌연변이를 도입하거나 다른 종류의 펩타이드 또는 단백질을 융합할 수도 있다. 도 3에서 보듯이, FGF와 BoNT의 융합 순서는 FGF-BoNT 또는 BoNT-FGF 순서일 수 있다. 이때, FGF와 BoNT 사이는 서로의 기능을 저해하지 않도록 적절한 길이의 펩타이드 링커(peptide linker, "linker peptide"라고도 함)로 연결될 수 있다. FGF와 BoNT 사이의 peptide linker는 절단이 일어나지 않는 peptide 또는 세포 외부 또는 endosome 내부에서 절단이 일어나는 서열로 디자인할 수 있다. 상기 본 발명의 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, 바람직하게는 Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 그 기능을 발휘하지 못하도록 변형되거나, 제외된 것일 수 있다. 이때, '변형'은 유전자 중 일부의 삭제 또는 치환 또는 파쇄를 의미하며, '제외'는 해당 유전자를 전체 삭제하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명은 FGF (Fibroblast growth factor)을 암호화하는 유전자와 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자가 결합된 폴리뉴클레오타이드를 대장균에 도입하여 발현시키되, 상기 보툴리눔 BoNT (Botulinum neurotoxin)을 암호화하는 유전자는, Hc 도메인을 암호화하는 유전자가 그 기능을 발휘하지 못하도록 변형되거나, 제외된 것을 특징으로 하는 FGF-BoNT 융합단백질의 생산방법을 제공한다. 이때, '변형'은 유전자 중 일부의 삭제 또는 치환 또는 파쇄를 의미하며, '제외'는 해당 유전자를 전체 삭제하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명은 FGF 단백질과 BoNT 단백질이 융합된 FGF-BoNT 융합단백질로써, 상기 BoNT 단백질은, Hc 도메인 활성이 소실되거나 Hc 도메인이 제거된 것을 특징으로 하는 FGF-BoNT 융합단백질을 제공한다. 상기 활성의 소실은 본 발명의 FGF-BoNT 융합단백질에서 Hc의 활성이 발생하지 않는 것을 의미한다. Hc의 활성이 발생하지 않는 것은, Hc가 부분적으로 손상을 입