KR-20260061032-A - A composition for the prevention or treatment of ischemic stroke sequelae containing human pluripotent stem cell-derived multipotent mesenchymal stem cells as an active ingredient

Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 허혈성 뇌졸중 발생 이후 생존율을 현저하게 증가시키고 신경손상을 예방 내지 회복시키는 바, 허혈성 뇌졸중 후유장애의 예방 및 치료를 위한 효과적인 세포치료제로 제공될 수 있다.

Inventors

• 정형민
• 김은영
• 이만열
• 오재상
• 홍기성
• 신정민

Assignees

• 주식회사 미래셀바이오

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20251022

Priority Date

20241025

Claims (7)

1. 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포 (MMSC)를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 투여 대상 개체의 단위 체중(60kg)당 1 × 10 7 내지 2 × 10 8 개의 MMSC를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 허혈성 뇌 신경 손상을 회복시키는 것인, 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 허혈성 뇌조직 손상에 의한 뇌 보호 효과를 나타내는 것인, 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Rock 1 또는 2의 활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
6. 개체에 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포 (MMSC)를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 개체는 인간을 제외한 포유동물인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 MMSC를 개체의 단위 체중(60kg)당 1 × 10 7 내지 2 × 10 8 개를 1회 이상 투여하는 것인, 방법.

Description

인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 또는 치료용 조성물{A composition for the prevention or treatment of ischemic stroke sequelae containing human pluripotent stem cell-derived multipotent mesenchymal stem cells as an active ingredient} 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명은 정부(과학기술정보통신부, 보건복지부)의 재원으로 (재)범부처재생의료기술개발사업단의 지원을 받아 완성되었다(22C0626L1). 뇌졸중(stroke)은 흔히 '중풍'으로 알려져 있으며, 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터짐으로써 그 부분의 뇌가 손상되어 급작스런 뇌혈류 장해에 의한 의식소실, 반신마비, 언어장애 등의 국소적 신경장애 증상을 일으킨 상태를 일컫는다. 뇌졸중은 크게 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중 (hemorrhagic stroke)으로 구분되는데, 허혈성 뇌졸중은 허혈성 및 재관류 손상으로 인한 폭발적인 신경 염증으로 뇌 조직을 손상시킨다. 특히 활성산소종(reactive oxygen species)과 세포 내 칼슘 과잉으로 인한 미토콘드리아 의존성 세포 사멸은 허혈성 뇌졸중에서 신경 손상의 병리학적인 메커니즘으로 널리 알려져 있다. 많은 경우 후유장애가 남아 일상생활에 장애를 초래하고 합병증을 남길 수 있다. 뇌졸중 후유증에는 대표적으로 마비, 연하(삼킴)장애, 인지기능장애와 실어증, 발음장애 같은 언어장애가 있다. 이를 완화하기 위해 항염증제와 같은 화학적 대안이 제안되었지만, 반감기가 짧고 혈액-뇌 장벽을 통과하여 손상 부위까지 도달하는데 어려움이 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 기반 치료법은 허혈성 뇌졸중 이후 병리학적 과정에 효과적으로 개입할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포(multipotent mesenchymal stem cell, MMSC)는 항염증 효과가 있다. 도 1a는 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 유도하기 위해 시행한 MCAO 수술 방법의 모식도로 ECA의 구멍을 통해 필라멘트를 삽입하여 MCA를 폐색하는 Longa의 전통적인 허혈-재관류 기법이다. 도 1b는 폐색 전, 폐색 도중, 재관류 후에 비침습적 레이저 도플러로 혈류를 측정한 결과이다. 도 1c는 마우스 모델의 MCAO 수술 및 MMSC 주입 계획과 전체 분석 과정의 모식도이다. 도 1d는 MMSC의 광학현미경 상 세포 사진이다(좌: 100배율, 우: 200배율). 도 2a는 야생형(WT), 중대뇌동맥 폐색(MCAO), BMSC 및 MMSC 그룹의 경색 부위 측정을 위한 TTC 염색 사진과 경색 크기 그래프이다. 도 2b는 해마 및 시상의 조직 손상 분석을 위한 H&E 염색 사진이다. 도 2c는 WT, MCAO, BMSC 및 MMSC 그룹에서 Iba1 유전자 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 3a는 그룹별 시간의 경과에 따른 생존 곡선이다. 도 3b는 그룹별 몸통 회전과 악력 점수 결과이다. 도 3c는 그룹별 라이트앤다크 테스트에서 밝은 영역 노출 시간을 측정한 결과이다. 도 3d는 그룹별 접착제 제거 테스트에서 접착제 제거 지연 시간을 측정한 결과이다. 도 3e는 그룹별 반즈 미로 테스트에서 지연 시간 및 거리를 측정한 결과이다. 도 3f는 그룹별 수동 회피 테스트의 구역 이동 지연 시간 및 오류 횟수 측정 결과이다. 도 4a는 그룹별 Rock 기전 활성화 확인을 위한 유전자 분석 그래프이다. 도 4b는 그룹별 Rock 기전에 의해 과활성화되는 α-SMA의 영향을 확인하기 위한 유전자 분석 그래프이다. 도 4c는 그룹별 혈액-뇌 장벽 보호 활성화 확인을 위한 유전자 분석 그래프이다. 도 4d는 그룹별 혈관 신생 활성화 확인을 위한 유전자 분석 그래프이다. 도 4e는 그룹별 Vegf 유전자 분석 그래프이다. 도 4f는 그룹별 신경 염증 활성화 확인을 위한 유전자 분석 그래프이다. 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌 조직 손상 등의 증상 조절의 용도에 제공하는 것이다. 본 발명에서 "인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포(multipotent mesenchymal stem cell, MMSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 중간엽줄기세포로서, 본 발명에서는 KR 10-2192307의 방법으로 제작된 유사 중간엽줄기세포를 이용하였다. 상기 "유사 중간엽줄기세포"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 골수의 기질, 연골, 골조직, 지방조직 등에 존재하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)와 유사한 기능을 갖는 세포로서, CD90및 SOX2등을 고발현함으로써 면역억제능, 항염증 효능 또는 다능성 유지력 등이 향상된 중간엽 줄기세포이다. 본 명세서에서 용어 "인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포"는 용어 "유사 중간엽줄기세포"와 혼용될 수 있다. 본 발명에서 이용한 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포는 인간 전분화능 줄기세포로부터 분리 배양하였다. 구체적으로 인간 전분화능 줄기세포는 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된 것을 이용하였다. 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된, 인간 전분화능 줄기세포를 37℃ 5% CO2 세포배양기에서 유지배양을 진행하였다. 유지배양된 인간 전분화능 줄기세포는 단순 효소처리에 의해 배양 플레이트로부터 분리하였다. 그리고, 배상체 형성을 통해, 낭성(Cystic) 배상체만 선별하였다. 세포투과성 3차원 배양삽입체를 새로운 배양 플레이트(6 well plate)에 결합시키기 전, 배양 시 최초 1회에 한하여, 새로운 배양플레이트에 먼저 2 mL의 배양액을 넣었다. 그리고, 2 mL의 배양액을 포함한 배양 플레이트에 세포투과성 3차원 배양삽입체를 결합시켰다. 그 후, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에 2 mL의 배양액을 추가로 넣고, 선별된 낭성 배상체를 결합된 세포 투과성 3차원 배양삽입체 위에 로딩하였다. 새로운 배양 플레이트에 넣은 배양액과 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액은 EGM-2MV를 사용하였다. 낭성 배상체가 로딩된 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액을 이틀동안 교체하지 않고 배상체를 배양하였다. 이후, 배양액을 제거하고, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에만 4 mL의 배양액을 추가로 넣고, 매일 배양액을 교체하여 유사 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하였다. 5-7일 동안 세포분화를 진행하였다. 상기 분리된 유사 중간엽 줄기세포에 있어서, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한, 군집 형태의 세포를 분리하였다. 분리된 군집 중 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적(mechanically)으로 제거하였다. 분리된 군집 중 단층(Monolayer) 형태의 군집만을 마이크로 파이펫 팁을 이용하여 가로 500 μm 이하, 세로 500 μm 이하의 크기로 잘라 균일화하여 선택적으로 배양하였다. 보다 바람직하게, 단층 형태의 군집은 가로와 세로 각각 100 μm ~ 500 μm의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 5-7일 동안 배양 후, 군집으로부터 단일세포 형태로 뻗어 나오는 유사 중간엽 줄기세포만을 분리하고, 계대 배양하여 증식시켰다. 단일세포 분리 전, 단일세포 형태가 아닌 군집 및 상피세포 모양의 세포들은 마이크로 파이펫 팁으로 완전히 제거하였다. 분리된 단일세포는 새로운 배양 플레이트로 옮겨 계대 배양을 통해 증식을 유도하였다. 이때, 배양 배지는 EGM-2MV를 사용하였다. 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포가 세포투과성 3차원 배양삽입체 아래로 이동하면, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 배양 플레이트로부터 분리하였다. 분리된 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포를 수득한 후 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적으로 제거하고, 단층(Monolayer) 형태의 군집의 크기를 균일화하여 선택적 배양하여 MMSC를 수득하였다. 이에, 본 발명에서 이용하는 MMSC는 (a) 인간 전분화능 줄기세포를 70회 이하 계대 배양하는 단계; (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계; (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체의 상부에 로딩하고 상기 배양삽입체의 하부로 이동한 중간엽 줄기세포의 군집을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 군집 중 단층 형태의 군집만을 분리하는 단계; 를 수행하여 수득되는 중간엽줄기세포인 것이 바람직하다. 본 발명자들은 항염증 효과가 확인된 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 허혈성 및/또는 재관류 손상에 의한 신경 염증을 증상으로 하는 허혈성 뇌졸중 후유장애 예방 및 치료에 이용될 수 있는지 확인하였다. 허혈성 뇌졸중 재현을 위하여 외경동맥 절개와 폐색을 유도한 MCAO 마우스를 제작하고, 상기 마우스에 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포를 투여한 후, 마우스의 악력 및 몸통 회전을 측정하여 신경학적 손상 정도를 측정하고, 마우스의 운동 및 인지 능력 변화를 확인하기 위하여 행동인지분석 실험을 진행하였다. 인간 전분화능 줄기세포 유래의 유사 중간엽줄기세포의 효과 비교를 위하여 항염증 효과가 알려진 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC)를 이용하였다. 그 결과, MCAO 마우스에 BMSC 또는 MMSC를 투여한 마우스는 아무것도 처리하지 않은 MCAO 그룹과 비교하여 생존율이 증가하였으며, 특히 MMSC를 투여한 마우스는 BMSC 투여군과 비교하여