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KR-20260061034-A - METHOD FOR MANUFACTURING NANO-BEADS TYPE POLYHYDROXYALKANOATES

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Abstract

본 발명은 나노비드 형태의 폴리하이드록시알카노에이트 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하는 박테리아의 세포 내에서 생성되는 폴리하이드록시알카노에이트를 이의 형태 그대로 직접 회수하기 위해 물리적 세포 파쇄를 수행하고, 이를 세척하는 공정을 최적화하였으며, 본 발명의 최적화된 폴리하이드록시알카노에이트 제조 방법을 이용하면 폴리하이드록시알카노에이트를 유기용매 없이 고순도 및 고수율로 제조할 수 있고, 별도의 성형 가공없이 나노비드 형태의 폴리하이드록시알카노에이트를 바로 수득할 수 있는 효과가 있다.

Inventors

  • 김성보
  • 김효정
  • 이상재

Assignees

  • 연세대학교 산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20251023
Priority Date
20241025

Claims (14)

  1. 1) 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates, PHA) 생성능을 가지는 박테리아를 배양하는 단계; 2) 박테리아 세포를 물리적 파쇄하여 폴리하이드록시알카노에이트를 분리하는 단계; 및 3) 상기 분리된 폴리하이드록시알카노에이트를 세척하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리(3-하이드록시프로피오네이트) (PHP 또는 P3HP), 폴리(3-하이드록시부티레이트) (PHB 또는 P3HB), 폴리(4-하이드록시부티레이트) (P4HB), 폴리(3-하이드록시발레레이트) (PHV 또는 P3HV), 폴리(4-하이드록시발레레이트) (P4HV), 폴리(5-하이드록시발레레이트) (P5HV), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트) (PHHx 또는 P3HHx), 폴리(3-하이드록시옥타노에이트) (PHO 또는 P3HO), 폴리(3-하이드록시데카노에이트) (PHD 또는 P3HD), 폴리(3-하이드록시운데카노에이트) (PHU, P3HU), 단쇄 (short-chain) 또는 중간쇄 (medium-chain) 길이의, 포화 또는 불포화 PHA, 또는 이들의 임의의 코폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 박테리아는 코베티아( Cobetia ), 랄스토니아( Ralstonia ), 비브리오( Vibrio ), 할로모나스( Halomonas ), 슈도모나스( Pseudomonas ), 로도슈도모나스( Rhodopseudomonas ), 바실러스( Bacillus ), 메틸로박테리움( Methylobacterium ), 메틸로시누스( Methylosinus ), 메틸로셀라( Methylocella ), 아조토박터( Azotobacter ), 알칼리게네스( Alcaligenes ), 에어로모나스( Aeromonas ), 노카르디아( Nocardia ), 메틸로캅사( Methylocapsa ), 메틸로칼둠( Methylocaldum ), 메틸로시스티스( Methylocystis ), 메틸로베르사틸리스( Methyloversatilis ), 루브리비박스( Rubrivivax ), 크산토박터( Xanthobacter ), 쿠프리아비두스( Cupriavidus ) 또는 하이드로게노파가( Hydrogenophaga ) 속(genus)에 속하는, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리아는 할로모나스 시안헨시스 HN-1-3-2 (기탁번호 KCTC 19195P)인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 물리적 파쇄는 초음파 또는 압력을 가하여 물리적으로 파쇄하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 고압 균질기를 이용하여 1000 내지 1300 bar로 압력을 가하여 물리적으로 파쇄하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 초음파 처리 세기(Amplification) 25 내지 35%의 조건으로 5 내지 20분 동안 초음파를 가하여 세포를 물리적으로 파쇄하는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 세척은 황산수소나트륨(NaHSO 3 )를 처리하여 수행되는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 황산수소나트륨은 200 ppm 내지 300ppm의 농도로 처리되는 것인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 3)단계에서 세척한 폴리하이드록시알카노에이트는 평균 입자 크기가 800nm 내지 900nm 인, 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 3)단계 이후 멸균하는 단계를 더 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  12. 청구항 1의 방법으로 제조된 폴리하이드록시알카노에이트.
  13. 청구항 12에 있어서, 콜로이드 상에 나노비드 형태로 분산된 것인, 폴리하이드록시알카노에이트.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 평균 입자 크기가 600nm 내지 800nm 인, 폴리하이드록시알카노에이트.

Description

나노비드 형태의 폴리하이드록시알카노에이트 제조방법{METHOD FOR MANUFACTURING NANO-BEADS TYPE POLYHYDROXYALKANOATES} 본 발명은 나노비드 형태의 폴리하이드록시알카노에이트 제조방법에 관한 것이다. 플라스틱은 인간생활의 편리성을 비약적으로 발달시킨 고분자 재료로, 경량성, 성형성, 가공성, 경제성 및 우수한 내구성으로 인하여 산업용 재료로부터 1회용 소모품에 이르기까지 여러 용도로 사용되고 있다. 그러나 산업 포장용, 식품 포장용, 생활용, 농원예용 등 범용적으로 사용되는 대부분의 플라스틱은 자연계에서 분해되지 않은 상태로 반영구적으로 존재하기 때문에 방치된 플라스틱의 처리로 인한 환경오염문제가 지속적으로 대두되었다. 이에 대한 대체 물질로 생분해성 플라스틱에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 생분해성 플라스틱이란 박테리아나 살아있는 유기체에 의해 분해될 수 있는 플라스틱으로, 오염물질을 남기지 않고 분해되기 때문에 해양의 미세 플라스틱 및 석유 기반 플라스틱의 이산화탄소 배출과 같은 고형 폐기물을 줄이는데 잠재적으로 기여할 것으로 기대되면서 생명 공학 분야에서 많은 관심을 받고 있다. 바이오 기반의 생 분해가 가능한 플라스틱을 생분해성 바이오 플라스틱이라고 하며, 대표적으로는 폴리락트산((poly lactic acid, PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates, PHA) 등이 있다. 생분해성 바이오 플라스틱은 매립 시 물과 이산화탄소로 6개월에서 5년 안에 분해가 가능하다. 현재 바이오 플라스틱은 연간 생산되는 3억 6천만 톤 이상의 플라스틱 중 약 1%인 2백만 톤이며, 그 중 생분해성 플라스틱은 약 120만 톤 정도 생산되고 있다. 그러나 2025년에는 180만 톤으로 증가할 것으로 예상되고 있으며, 특히 폴리하이드록시알카노에이트의 시장 성장률은 10배 가량 증가할 것으로 예상된다. 수요가 증가하고 성능이 발전된 바이오 폴리머 및 제품이 늘어남에 따라 바이오 플라스틱 시장은 지속적으로 성장하고 다양해질 것으로 전망된다. 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates, PHA)는 다양한 미생물에 의해 제한된 영양 조건에서 생산되는 세포 내 에너지 저장 화합물로, 여러 종류의 하이드록시 카르복실산으로 구성되는 생분해성 고분자이다. 폴리하이드록시알카노에이트는 기존의 석유로부터 유래된 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(polybutylene adipate terephthalate; PBAT), 폴리부틸렌 숙시네이트(polybutylene succinate; PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 테레프탈레이트 (polybutylene succinate terephthalate; PBST), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(polybutylene succinate adipate; PBSA)등과 같은 합성 고분자와 유사한 물성을 가지면서, 완전한 생분해성을 보이며, 생체적합성 또한 우수하다. 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 단량체의 종류와 비율을 조절하여 기계적 특성과 녹는점을 조절할 수 있기 때문에, 의학, 식품, 에너지 등과 같은 다양한 산업 분야에서 석유 플라스틱의 대안으로 사용되고 있다. 도 1은 NaHSO3의 농도 별 세척에 따른 입자 크기를 나타낸 것이다. 도 2 및 3은 멸균 조건에 따른 폴리하이드록시알카노에트의 입자 크기를 나타낸 것이다. 도2는 온도별, 도3은 시간별 조건에 따른 분석결과이다. 도 4는 본 발명의 일시시예에 따른 완제 공정에서 Sucrose 및 glycerol 첨가 시료의 온도별 입도 변화를 나타낸 것이다. 도 5 및 6은 본 발명의 일시시예에 따른 완제 공정에서 Sucrose 및 glycerol 10% (v/v), 5% (v/v), 1% (v/v) 첨가 직후 DLS (1일차, 도 4), Sucrose 및 glycerol 10% (v/v), 5% (v/v), 1% (v/v) 첨가 7일 후 DLS (8일차, 도 5)을 나타낸 것이다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 1) 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates, PHA) 생성능을 가지는 박테리아를 배양하는 단계; 2) 박테리아 세포를 물리적 파쇄하여 폴리하이드록시알카노에이트를 분리하는 단계; 및 3) 상기 분리된 폴리하이드록시알카노에이트를 세척하는 단계를 포함한다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 예를 들어, 폴리(3-하이드록시프로피오네이트) (PHP 또는 P3HP), 폴리(3-하이드록시부티레이트) (PHB 또는 P3HB), 폴리(4-하이드록시부티레이트) (P4HB), 폴리(3-하이드록시발레레이트) (PHV 또는 P3HV), 폴리(4-하이드록시발레레이트) (P4HV), 폴리(5-하이드록시발레레이트) (P5HV), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트) (PHHx 또는 P3HHx), 폴리(3-하이드록시옥타노에이트) (PHO 또는 P3HO), 폴리(3-하이드록시데카노에이트) (PHD 또는 P3HD), 폴리(3-하이드록시운데카노에이트) (PHU, P3HU), 단쇄 (short-chain) 또는 중간쇄 (medium-chain) 길이의, 포화 또는 불포화 PHA, 또는 이들의 임의의 코폴리머 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 박테리아는 예를 들어, 코베티아(Cobetia), 랄스토니아(Ralstonia), 비브리오(Vibrio), 할로모나스(Halomonas), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 바실러스(Bacillus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로셀라(Methylocella), 아조토박터(Azotobacter), 알칼리게네스(Alcaligenes), 에어로모나스(Aeromonas), 노카르디아(Nocardia), 메틸로캅사(Methylocapsa), 메틸로칼둠(Methylocaldum), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로베르사틸리스(Methyloversatilis), 루브리비박스(Rubrivivax), 크산토박터(Xanthobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus) 또는 하이드로게노파가(Hydrogenophaga) 속(genus)에 속하는 것일 수 있고, 더욱 구체적인 예를 들면, 할로모나스 시안헨시스 HN-1-3-2 (기탁번호 KCTC 19195P)일 수 있다. 상기 물리적 파쇄는 당분야에 공지된 방법 및 조건으로 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 초음파 또는 압력을 가하여 물리적으로 파쇄하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 압력은 고압 균질기를 이용하여 1000 내지 1300 bar로 압력을 가하여 수행될 수 있고, 초음파는 25 내지 35% 세기(Amplication)로 5 내지 20분 동안 수행될 수 있다. 상기 세척은 황산수소나트륨(NaHSO3)를 처리하여 수행되는 것일 수 있다. 황산수소나트륨을 이용하여 세척하는 경우, 분리된 폴리하이드록시알카노에이트 나노 비드가 응집되지 않는 효과를 달성할 수 있다. 상기 황산수소나트륨은 예를 들어, 200 ppm 내지 300 ppm의 농도로 처리되는 것일 수 있다. 상기 세척 과정을 거친 폴리하이드록시알카노에이트는 평균 입자 크기가 800 nm 내지 900 nm 일 수 있다. 세포 내 생합성되는 폴리하이드록시알카노에이트는 평균 입자 크기가 약 1000 nm 미만이고, 상기 물리적 파쇄를 통해 분리한 폴리하이드록시알카노에이트의 평균 입자 크기는 400 nm 내지 900 nm 일 수 있다. 상기 세척 과정을 통해 800 nm 내지 900 nm의 균일한 평균 입자 크기를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트를 얻을 수 있다. 본 발명은 필요에 따라 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 멸균은 당분야에 공지된 방법 및 조건으로 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 멸균은 고압증기 멸균방법으로 수행될 수 있다. 더욱 구체적인 예를 들어, 70 ℃ 내지 90 ℃에서 50분 내지 70분 동안 멸균이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 80 ℃에서 60분동안 수행될 수 있다. 또한 본 발명은 필요에 따라 멸균된 폴리하이드록시알카노에이트를 콜로이드 상에 분산시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 당분야에 공지된 방법 및 조건으로 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 당류(글리세롤 또는 수크로스)를 첨가하여 수행될 수 있다. 더욱 구체적인 예를 들면, 수크로스를 1% (v/v) 이상 또는 1 내지 10%(v/v) 첨가하여 수행될 수 있다. 또한, 글리세롤을 5% (v/v) 이상 또는 5 내지 10%(v/v) 첨가하여 수행될 수 있다. 본 단계를 통해 멸균된 PHA 나노비드의 응집을 억제하여, 600 nm 내지 800nm 의 평균 입자 크기를 갖도록 할 수 있으며, 콜로이드 상의 안정성을 확보할 수 있다. 본 발명은 상기 방법으로 제조된 폴리하이드록시알카노에이트에 관한 것이다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 콜로이드 상에 나노비드 형태로 분산된 것일 수 있다. 상기 콜리이드 상에 나노비드 형태로 분산된 폴리하이드록시알카노에이트 평균 입자 크기가 예를 들어, 600 nm 내지 800 nm 일 수 있다. 이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 1. 세포배양 Halomonas xianhensis HN-1-3-2가 PHA 생산 균주로 사용되었다. 균주가 생육하는 배지 조건은 MB 배지를 모티브로한 재조합 배지인 ASS Media를 사용하였다. ASS 배지는 Soy peptone 5 g/L, Yeast extract 1 g/L, Artificial sea salt 30 g/L로 구성된다. PHA생산을 위한 5 L scale의 균주 배양은 Pre-culture, Transfer-culture, Production-culture 단계로 진행하였다. Seed를 위한 균주 배양은 Soy peptone 5 g/L, Yeast extract 1 g/L, Artificial sea salt 30 g/L에