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KR-20260061104-A - A filler composition for tissue restoration comprising, as an active ingredient, hyaluronic acid based on double cross-link using cross-linking agents with excellent biocompatibility

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Abstract

본 발명은 (a) 히알루론산 및 오르니틴을 가교하는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 오르니틴으로 가교된 히알루론산을 STMP(Sodium Trimetaphosphate)와 추가로 가교하는 단계를 포함하는 가교 히알루론산 제조방법; 상기 방법으로 제조된 가교 히알루론산; 오르니틴 및 STMP로 가교된 히알루론산; 상기 가교 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물, 필러 조성물, 및 생체 투여용 조성물; 오르니틴, STMP, 및 히알루론산을 포함하는 가교 히알루론산, 조직 수복용 생체 재료, 필러, 및 생체 투여제 제조용 조성물; 화학식 3 내지 7의 단위체 중 어느 하나 이상을 포함하는 복합 조성물; 및 이를 포함하는 조직 수복용 조성물, 필러 조성물, 및 생체 투여용 조성물에 관한 것이다.

Inventors

  • 원치엽
  • 최복열
  • 엄건희
  • 김서영
  • 박수진

Assignees

  • 주식회사 파마리서치바이오

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20260406
Priority Date
20231221

Claims (6)

  1. 히알루론산이 히알루론산 투입량 대비 0.5 내지 25 중량%의 오르니틴에 의해 1차 가교되고, 히알루론산 투입량 대비 1 내지 130 중량%의 STMP에 의해 2차 가교된 가교 히알루론산으로서, 상기 가교 히알루론산은 하기 화학식 3 및 4를 포함하거나, 화학식 3및 5를 포함하는 것인, 가교 히알루론산; [화학식 3] [화학식 4] [화학식 5] .
  2. 제1항에 있어서, 상기 가교 히알루론산은 1.0 Hz에서의 위상각(Phase angle)이 80° 이하인 것인, 가교 히알루론산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가교 히알루론산은 100 Pa 내지 1,000 Pa의 저장 탄성계수(G')를 갖는 것인, 가교 히알루론산.
  4. 제1항의 가교 히알루론산을 포함하는 조직수복용 조성물.
  5. 제1항의 가교 히알루론산을 포함하는 필러 조성물.
  6. 제1항의 가교 히알루론산을 포함하는 생체 투여용 조성물.

Description

생체적합성이 우수한 가교제를 이용한 이중 가교 기반의 히알루론산을 유효성분으로 하는 조직 수복용 필러 조성물 {A filler composition for tissue restoration comprising, as an active ingredient, hyaluronic acid based on double cross-link using cross-linking agents with excellent biocompatibility} 본 발명은 (a) 히알루론산 및 오르니틴을 가교하는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 오르니틴으로 가교된 히알루론산을 STMP(Sodium Trimetaphosphate)와 추가로 가교하는 단계를 포함하는 가교 히알루론산 제조방법; 상기 방법으로 제조된 가교 히알루론산; 오르니틴 및 STMP로 가교된 히알루론산; 상기 가교 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물, 필러 조성물, 및 생체 투여용 조성물; 오르니틴, STMP, 및 히알루론산을 포함하는 가교 히알루론산, 조직 수복용 생체 재료, 필러, 및 생체 투여제 제조용 조성물; 화학식 3 내지 7의 단위체 중 어느 하나 이상을 포함하는 복합 조성물; 및 이를 포함하는 조직 수복용 조성물, 필러 조성물, 및 생체 투여용 조성물에 관한 것이다. 조직 수복용 생체 재료는 조직 주사가 가능한 형태로 조직의 볼륨을 회복하는 데에 사용되고 있고, 특히 피부 주름, 기타 얼굴 라인 변화 등 필러의 사용도 증가되고 있다. 예를 들어, 전 세계의 수요 증가로 세계 피부 필러 시장이 2021년 약 50억 달러에서 2031년 약 310억 달러에 이르고, 시장은 2022년~2031년 8%의 연평균성장률을 기록할 것으로 전망되고 있다. 그 중에서도 히알루론산 필러는 높은 안정성 및 낮은 부작용으로 분해성 필러의 주요성분으로서 전체 시장의 90%를 차지하고 있다. 일반적으로 히알루론산 필러 제조 시 히알루론산이 장시간 체내에서 분해되지 않고 유지되도록 하는 가교제를 사용하고 있는데(KR 10-2051467 B1), 기존의 히알루론산 가교제로 널리 사용되는 DVS(Divinyl Sulfone) 및 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)은 생체 독성이 있는 등(안전화학공단 물질안전보건자료 시스템), 안정성이 우수한 필러의 개발은 미미한 실정이다. 도 1은 다양한 가교제의 생체 적합성 평가 결과를 나타낸 도이다. 도 2는 오르니틴 농도에 따른 탄성 결과를 나타낸 도이다. 도 3은 STMP 단독 가교 제형 형상을 나타낸 도이다. 도 4는 오르니틴과 STMP의 가교 순서에 따른 탄성 영향을 확인한 결과이다. 도 5는 오르니틴 및 STMP 이중 가교에서 오르니틴 농도별 탄성 영향을 나타낸 도이다. 도 6은 오르니틴 및 STMP 이중 가교에서 STMP 농도별 탄성 영향을 나타낸 도이다. 도 7은 오르니틴 및 STMP 이중 가교에서 히알루론산의 분자량 별 탄성 영향을 나타낸 도이다. 이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다. 실시예 1. 가교제 종류에 따른 생체 적합성 평가 공지된 방법(Chang Hee Jeong, et al., 2021, Toxicology In vitro Feb;70:105034; ISO10993-5)을 이용하여 다양한 가교제의 생체 적합성을 세포독성으로 평가하였다. 음성/양성 대조군 및 실험군은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 실험군으로 사용한 DVS(Divinyl Sulfone) 및 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)은 기존에 널리 사용되던 가교제이며, 본 발명에서는 오르니틴과 STMP가 가교제로 적합한지를 확인하고자 생체 적합성을 평가하였다. 대조군음성대조군: high-density polyethylene film양성대조군: polyurethane film containing 0.1% zinc diethyldithiocarbamate (ZDEC)실험군(DVS, BDDE, 오르니틴, STMP 오르니틴+STMP)0 ppm5 ppm25 ppm100 ppm500 ppm1,000 ppm 구체적으로, HDF (human dermal fibroblast)를 세포 밀도 1 X 104 세포/웰로 하여 96 웰-플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 표 1의 대조군 및 실험군 시료를 0 내지 1,000ppm으로 처리하고 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 WST reagent를 처리하고 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 반응한 후 450nm에서 흡광도(OD450)를 측정하였다. 세포 생존률(cell viability)을 다음과 같이 도출하여 실험군 및 대조군 처리에 따라 세포 생존률이 30% 이상 감소할 경우 세포독성이 있는 것으로 하였다. - Viability (%) = (Exp.- Blank)/(Control - Blank) X 100 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 기존에 사용된 공지 가교제인 DVS는 5 ppm부터, BDDE는 100 ppm부터 세포독성을 나타내었고 오르니틴 단독과 STMP 단독은 1,000 ppm까지 세포독성을 보이지 않았다. 또한, 오르니틴 및 STMP 혼합액의 경우에도 1,000 ppm까지 세포 독성을 보이지 않았다. 이에, 기존에 널리 사용되던 가교제인 DVS 및 BDDE에 비해 오르니틴, STMP, 및 오르니틴 및 STMP 혼합물의 생체적합성이 높음을 확인하였다. 상기 결과를 토대로, 본 발명에서는 가교제로 오르니틴; STMP; 오르니틴 및 STMP을 사용하여 실험을 수행하였다. 실시예 2. 오르니틴 단독 가교 히알루론산 제형 제조 및 결과 2-1. 오르니틴 단독 가교 히알루론산 제형 제조 오르니틴으로 단독 가교한 히알루론산(Hyaluronic acid; HA)을 제조하였다. 이 때, 히알루론산은 분자량이 20 kDa 내지 2,000 kDa인 것, 초기 오르니틴 농도는 히알루론산 대비 0.35 중량% 내지 8.7 중량%인 것을 이용하였다. 오르니틴으로 단독 가교한 히알루론산 제조를 위해, 히알루론산 및 오르니틴을 pH 4 ~ 6에서 용해시키고, NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 첨가하여 이들을 30분 동안 혼합하였다. 이후, EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 첨가하고 3시간 동안 혼합 및 가교하였다. NaOH 용액을 첨가하고 에스터 결합을 분해시켰으며, HCl 용액을 첨가하여 중화하였다. PBS에서 투석(Dialysis)을 4일 동안 수행하였다. 유리 히알루론산(Free HA) 및 리도카인을 첨가 또는 미 첨가하고 분쇄 및 최종 농도 조정을 수행하였다. 2-2. 탄성 확인 위상각(Phase angle)은 재료의 탄성 정도를 분석하는데 사용되는 것으로서, 실험에서 사용한 위상각의 상세 분석 조건은 표 2와 같다. Oscillation (1.0 Hz 값 확인)GeometryParallel Plate 20 mmLoading gap1.0 mmFrequency0.1 ~ 10 Hz 위상각 0°는 100% 탄력이 있는 물질로서(elastic material) 고체(solid)를 나타내며 위상각 90°는 100% 유동적인 물질(viscous material)로서 액체(liquid)를 나타낸다. 필러로 사용되기 위해서는 위상각이 80°이하여야 한다(WO 2016-096920 A1). 오르니틴 농도를 토대로 탄성을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 오르니틴 농도를 0.35 중량%), 8.7 중량%로 하여 탄성을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 오르니틴 농도가 8.7 중량%일 때 탄성 수치가 더 높음을 확인하였다. 실시예 3. STMP 단독 가교 히알루론산 제형 제조 및 결과 3-1. STMP 단독 가교 히알루론산 제형 제조 STMP로 단독 가교한 히알루론산은 하기와 같이 제조하였다. 이 때, 히알루론산은 분자량이 20 kDa 내지 2,000 kDa인 것을 이용하였다. STMP로 단독 가교한 히알루론산 제조(WO 2014/181147 A1)를 위해, 25M NaOH 용액에서 2시간 반 동안 용해시킨 히알루론산과 0.25M NaOH 용액에서 용해시킨 STMP 용액을 30분 동안 혼합하여 50 ℃에서 15시간 동안 가교반응을 수행하였다. 3-2. 가교 반응 진행 확인 STMP 투입 후 가교 반응이 진행됨에 따라 pH가 하강하였으며, 가교 반응이 종결된 후 pH는 8.58로 측정되었다. 가교가 진행됨에 따라 유리 인산기가 발생하여 pH가 하강하므로 pH가 낮아지는 것은 가교 반응이 진행됨을 의미한다. 3-3. 탄성체 미형성 확인 2-2에서 실험한 동일한 조건으로 위상각을 이용하여 STMP의 탄성체 형성 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, STMP 단독 가교 히알루론산의 경우 위상각 84.9°로 탄성체를 형성하지 못함을 확인하였다(도 3). 상기 결과는 STMP 단독 가교의 경우 조직 수복이 불가할 수 있음을 시사한다. 따라서, STMP로 단독 가교반응한 히알루론산은 탄성체를 형성하지 못하여 HCl을 통한 중화단계 등 후속 단계를 진행하지 않았다. 실시예 4. 오르니틴 및 STMP 이중 가교 히알루론산 제형 제조 및 결과 4-1. 오르니틴 및 STMP 이중 가교 순서에 따른 히알루론산 제형 제조 오르니틴 및 STMP(Sodium Trimetaphosphate) 가교 순서에 따른 영향 확인을 위한 STMP 가교 후 오르니틴으로 가교한 이중 가교 히알루론산을 제조하였다. 이 때, 히알루론산은 분자량이 20 kDa 내지 2,000 kDa인 것, 초기 오르니틴 농도는 히알루론산 대비 0.1 중량%내지 15 중량%, 초기 STMP 농도는 히알루론산 대비 0.1 중량% 내지 250 중량% 인 것을 이용하였다. 4-1-1. STMP 가교 후 오