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KR-20260061147-A - 게놈 편집 기술

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Abstract

게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서의 게놈 편집 대상 영역에서 표적으로 하는 염기 서열의 결실, 치환 또는 삽입을 수행하는 방법으로서, (1) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 상기 게놈 편집 대상 영역에 도입하는 공정; 및 (2) 도입한 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식하는 II형 제한 엔도뉴클레아제를 상기 생물 또는 세포에 발현시킴으로써 게놈에 2본쇄 절단(DSB)을 발생시키는 공정을 포함하고, 상기 (1) 및 (2)의 공정을 수행한 후, 상기 생물 또는 세포에서 게놈 편집용 유전자 서열과의 상동 재조합 수복을 거쳐 대상 영역이 편집되는 것이며, 상기 생물 또는 세포에서의 게놈 중의 GC 함량이 65% 이상인 방법에 의해, 생물 일반, 특히 방선균을 대상으로 하는 게놈 편집 기술로서, 개변 후의 생물 또는 세포는 재조합체에 해당하지 않고, 또한 오프 타겟 효과를 회피할 수 있는 게놈 편집 기술을 제공할 수 있었다.

Inventors

  • 야마나카 카즈야
  • 사쿠라이 노부키

Assignees

  • 더 스쿨 코포레이션 칸사이 유니버시티
  • 제이엔씨 주식회사

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240829
Priority Date
20230830

Claims (20)

  1. 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서의 게놈 편집 대상 영역에서 표적으로 하는 염기 서열의 결실, 치환 또는 삽입을 수행하는 방법으로서, (1) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 상기 게놈 편집 대상 영역에 도입하는 공정; 및 (2) 도입한 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식하는 II형 제한 엔도뉴클레아제를 상기 생물 또는 세포에 발현시킴으로써 게놈에 2본쇄 절단(DSB)을 발생시키는 공정을 포함하고, 상기 (1) 및 (2)의 공정을 수행한 후, 상기 생물 또는 세포에서 게놈 편집용 유전자 서열과의 상동 재조합 수복을 거쳐 대상 영역이 편집되는 것이며, 상기 생물 또는 세포에서의 게놈 중의 GC 함량이 65% 이상인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제가 A와 T만으로 구성되는 염기 서열을 인식하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제가 PacI인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 생물이 게놈 중에 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 가지지 않는 진핵생물 또는 원핵생물인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 생물이 방선균인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 방선균이 게놈 중에 PacI의 인식 서열을 가지지 않는 방선균인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 방선균이 Streptomyces속, Saccharopolyspora속 및 Amycolaptosis속으로 이루어진 군에서 선택되는 방선균인 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 방선균이 Streptomyces fradiae, Streptomyces venezuelae, Streptomyces griseus, Streptomyces albulus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces avermitilis, Amycolatopsis orientalis, 및 Saccharopolyspora spinosa로 이루어진 군에서 선택되는 방선균인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(1)에서의 도입이 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 도입용 벡터를 이용하여 수행되는 것이며, 상기 도입용 벡터가 (i) 게놈 편집용 유전자 서열, (ii) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열, (iii) 상기 도입용 벡터의 클로닝에 이용하는 숙주 생물에서 작동하고, 또한 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하지 않는 복제 기점 서열, 및 (iv) 약제 내성 유전자 서열을 포함하는 벡터인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 복제 기점 서열이 p15A ori 서열인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 도입용 벡터가 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서의 항상 발현 프로모터 서열 및 그 하류에 작동 가능하게 배치된 네거티브 셀렉션 유전자 서열을 더 포함하고, 및 임의로 상기 네거티브 셀렉션 유전자 서열은 코돈 최적화된 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항상 발현 프로모터 서열이 ermE 프로모터(PermE) 서열이고, 및/또는 네거티브 셀렉션 유전자 서열이 codA 유전자 서열인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, (3) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 도입된 세포를 상기 네거티브 셀렉션 유전자를 이용하여 셀렉션하는 공정을 더 포함하는 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(2)이 도입한 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식하는 II형 제한 엔도뉴클레아제의 발현용 벡터를 이용하여 수행되는 것이며, 상기 발현용 벡터가 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하는 프로모터 서열 및 그 하류에 작동 가능하게 배치된 II형 제한 엔도뉴클레아제 서열을 포함하고, 및 상기 발현용 벡터의 클로닝에 이용하는 숙주 생물에서 작동하고, 또한 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하지 않는 복제 기점 서열, 약제 내성 유전자 서열 및 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하는 온도 감수성 복제 기점 서열을 포함하는 벡터인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 프로모터 서열이 유도 발현 프로모터 서열이고, 상기 발현용 벡터의 클로닝에 이용하는 숙주 생물에서 작동하고, 또한 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하지 않는 복제 기점 서열이 pUC ori 서열이고, 및/또는 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하는 온도 감수성 복제 기점 서열이 pSG5rep 서열인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 유도 발현 프로모터 서열이 tipA 프로모터(PtipA) 서열인 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 발현용 벡터가 오퍼레이터 서열 및 리프레서 서열을 포함하고, 상기 오퍼레이터 서열은 상기 프로모터 서열과 전사 개시점의 사이에 삽입된 것이며, 및 임의로 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제 서열은 코돈 최적화된 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 오퍼레이터 서열이 lacO 서열이고, 및/또는 상기 리프레서 서열이 lacI 서열인 방법.
  19. 청구항 14에 있어서, (4) 상기 발현용 벡터를 상기 온도 감수성 복제 기점의 온도 감수성에 기초하여 상기 생물 또는 세포로부터 배제하는 공정을 더 포함하는 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정(1)에서의 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열의 도입과, 상기 공정(2)에서의 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식하는 II형 제한 엔도뉴클레아제의 발현을 단일 벡터에서 수행하는 방법으로서, 상기 단일 벡터가 (i) 게놈 편집용 유전자 서열, (ii) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열, (iii) 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하는 프로모터 서열 및 그 하류에 작동 가능하게 배치된 II형 제한 엔도뉴클레아제 서열, (iv) 상기 단일 벡터의 클로닝에 이용하는 숙주 생물에서 작동하고, 또한 상기 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서 작동하지 않는 복제 기점 서열, 및 (v) 약제 내성 유전자 서열을 포함하는 벡터인 방법.

Description

게놈 편집 기술 본 발명은 생물 일반, 특히 방선균을 대상으로 하는 게놈 편집 기술에 관한 것이다. 방선균은 다종다양한 창약 시드 화합물을 2차 대사산물로서 생산하기 때문에 예로부터 의약품 산업분야에서 중요한 역할을 하여 왔다. 그러나, 2차 대사산물은 생산균 자신의 생육에는 필수가 아니기 때문에 그 생산량은 극히 미량이며, 나아가 복수의 대사산물도 병행 생산하기 때문에 주생산물의 생산 향상을 겨냥한 병행 생산 2차 대사 경로의 폐쇄나 대사 플럭스 개변 등, 게놈 개변에 의한 고생산 변이주의 육종 연구가 정력적으로 수행되어 왔다. 게놈 개변 기술로서 예를 들면 상동 재조합의 수법이 널리 알려져 있다. 그러나, 상동 재조합의 수법은 높은 특이성으로 표적 영역을 개변 가능한 반면, 표적 유전자와 약제 내성 유전자를 치환시키기 위해 개변 후의 게놈에는 외래 유전자가 잔존한다. 그 때문에, 개변 후의 생물 또는 세포는 재조합체에 해당한다. 따라서, 실제 상업 생산에서의 퍼블릭 억셉턴스가 얻어지기 어려운 것이 문제가 되어 있고, 또한 게놈 개변에 이용 가능한 약제 내성 유전자에도 한계가 있기 때문에 복수 유전자 영역의 개변, 이른바 다중 개변도 곤란하다. 그 후 개발된 Cre-LoxP 시스템을 이용함으로써 다중 개변을 수행할 수 있다고 널리 알려져 있지만, 개변 후의 게놈에는 LoxP 사이트가 잔존하여 재조합체에 해당하는 것에 의한 문제는 해소할 수 없는 상태였다. 한편, 최근 주목을 끄는 CRISPR-Cas9를 이용한 게놈 편집 시스템에서는 개변 후의 게놈 상에 이종 생물 유래 서열을 남기지 않고 임의의 유전자 영역을 대규모로 결실시킬 수 있다. 그러나, 게놈 상에 2본쇄 절단(DSB)을 도입하는 역할을 하는 Cas9 뉴클레아제의 서열 인식에는 protospacer-adjacent motif(PAM)가 필요하고, 일반적으로 이용되고 있는 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9의 PAM는 G 리치 및 3염기(5'-NGG-3')이다. 그러나, 이 서열은 GC 함량 약 70%의 방선균 게놈 전체에 분포되고, Streptomyces coelicolor 게놈에는 1000bp당 260개소 존재한다(비특허문헌 1). 따라서, 비특이적인 게놈 절단이 독성 발현을 유도하는 데다가 고빈도로 오프 타겟 효과를 일으키기 때문에 그 적응은 곤란하다. 이 기술 과제를 해소하기 위해 T 리치 PAM 서열(5'-TTV-3')을 인식하는 Francisella novicida 유래의 Cas9, Cpf1를 이용한 방선균 특유의 게놈 편집 기술이 개발되었다(비특허문헌 1). 그러나, 그 PAM 서열의 방선균 게놈에서의 분포는 적고, 편집 대상 영역으로 뉴클레아제를 특이적으로 유도하는 것은 곤란하기 때문에 범용적으로 이용되는 일은 없었다(비특허문헌 2). GC 함량이 높고 반복 서열이 많은 방선균 게놈의 원하는 영역의 선택적 편집을 실현하기 위해서는 GC 함량이나 반복 서열에 좌우되지 않고 편집 대상 영역에 특이적으로 DSB를 도입할 수 있는 뉴클레아제가 필요하다. 그 후보가 될 수 있는 뉴클레아제로서 진핵생물에서 RNA 스플라이싱에 관여하는 호밍 엔도뉴클레아제를 들 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는 극히 긴 염기 서열(14 ~ 40bp)을 인식하기 때문에(비특허문헌 3), 게놈 DNA에는 존재하지 않는 인식 서열을 미리 편집 대상 영역에 도입해 둠으로써 특이적인 DSB 도입이 가능해지기 때문에 실제로 게놈 편집 기술로서 응용되어 있다(비특허문헌 4). 그 반면, 표적이나 숙주의 서열이 다양화되어도 독성을 회피하면서 인트론이나 인테인을 정확하게 절단하기 위해 인식 서열의 엄밀성은 낮다는 성질이 있다(비특허문헌 3). 따라서, 수 염기 정도의 차이이면 절단할 수 있기 때문에 Cas9와 같이 오프 타겟 효과를 일으키는 문제를 완전히 회피하는 것은 곤란하다고 생각된다. 그 때문에, 해당 호밍 엔도뉴클레아제를 이용한 게놈 편집 기술이 GC 함량이 높은 방선균의 게놈 편집에 응용된 예는 없다. [도 1] 2종류의 벡터를 이용하였을 때의 게놈 편집의 모식도를 나타낸다. [도 2] 액티노로딘 생합성 유전자군의 모식도를 나타낸다. [도 3] pPacIint의 벡터 맵을 나타낸다. [도 4] pSET152-PtipA-gfpuv-tsr의 벡터 맵을 나타낸다. [도 5] pSET152-PtipA-gfpuv-pSG5rep의 벡터 맵을 나타낸다. [도 6] Streptomyces lividans에서의 티오스트렙톤 농도 의존적 GFP 발현을 나타내는 도면이다. 좌측 패널은 티오스트렙톤 농도 의존적으로 GFP를 발현하는 S. lividans의 무세포 추출액을 자외선 조사하에서 관찰한 사진이며, 우측 패널은 형광 강도를 나타내는 그래프이다. [도 7] Streptomyces albulus에서의 티오스트렙톤 농도 의존적 GFP 발현을 나타내는 도면이다. 좌측 패널은 티오스트렙톤 농도 의존적으로 GFP를 발현하는 S. albulus의 무세포 추출액을 자외선 조사하에서 관찰한 사진이며, 우측 패널은 형광 강도를 나타내는 그래프이다. [도 8] Streptomyces coelicolor에서의 티오스트렙톤 농도 의존적 GFP 발현을 나타내는 도면이다. 좌측 패널은 티오스트렙톤 농도 의존적으로 GFP를 발현하는 S. coelicolor의 무세포 추출액을 자외선 조사하에서 관찰한 사진이며, 우측 패널은 형광 강도를 나타내는 그래프이다. [도 9] pSET152-PtipA(lacO)-gfp-tsr-pSG5rep의 벡터 맵을 나타낸다. [도 10] pSET152-PtipA(lacO)-gfp-tsr-pSG5rep-lacI의 벡터 맵을 나타낸다. [도 11] pPacIintΔact의 벡터 맵을 나타낸다. [도 12] PacI 인식 서열이 게놈 상에 삽입된 편집 중간체주의 조성 스킴을 나타낸다. [도 13] 편집 중간체주에 pELIM를 도입함으로써 얻은 형질전환체를 나타내는 사진이다. [도 14] 액체 배양에 의한 액티노로딘 생산을 확인한 사진이다. [도 15] 상측 패널은 편집 중간체 및 편집 완료체, 야생 복귀주의 모식도를 나타낸다. 하측 패널은 형질전환체의 표현형을 나타내는 사진(좌) 및 유전자형 해석을 나타내는 사진(우)이다. [도 16] 액티노로딘 생합성 유전자군에서의 게놈 편집 영역 주변의 시퀀스 해석도이다. [도 17] pPacIintΔactVB의 벡터 맵을 나타낸다. [도 18] pELIM 도입주의 유전자형 해석을 나타내는 도면이다. 상측 패널은 actVB 결실의 모식도를 나타낸다. 하측 패널은 각 샘플에서의 유전자형 해석을 나타내는 사진이다. [도 19] actVB 결실에서의 편집 영역의 게놈 편집 영역 주변의 시퀀스 해석도이다. [도 20] 단일 벡터를 이용하였을 때의 게놈 편집의 모식도(우), 및 제작한 벡터(pELIM-Δact1)를 제한 효소 처리한 결과를 나타내는 사진(좌)이다. [도 21] 편집 중간체 및 편집 완료체, 야생 복귀주의 모식도(좌), 및 액체 배양에 의한 액티노로딘 생산을 확인한 사진(우)이다. 해당 사진에서 우측의 튜브가 원하는 편집 완료체이며, 좌측이 야생 복귀주를 나타낸다. <게놈 편집 방법> 본 발명의 일 실시형태는 게놈 편집 대상의 생물 또는 세포에서의 게놈 편집 대상 영역에서 표적으로 하는 염기 서열의 결실, 치환 또는 삽입을 수행하는 방법으로서, (1) II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 상기 게놈 편집 대상 영역에 도입하는 공정; 및 (2) 도입한 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식하는 II형 제한 엔도뉴클레아제를 상기 생물 또는 세포에 발현시킴으로써 게놈에 2본쇄 절단(DSB)을 발생시키는 공정을 포함하고, 상기 (1) 및 (2)의 공정을 수행한 후, 상기 생물 또는 세포에서 게놈 편집용 유전자 서열과의 상동 재조합 수복을 거쳐 대상 영역이 편집되는 것이며, 상기 생물 또는 세포에서의 게놈 중의 GC 함량이 65% 이상인 방법이다. 본 발명에서 게놈 편집이란 게놈 편집 대상 영역에서 표적으로 하는 염기 서열의 결실, 치환 또는 삽입을 수행하는 것이다. 게놈 편집 대상 영역이란 게놈 편집을 수행하는 표적 유전자를 포함한 영역으로, 표적 유전자만으로 이루어진 영역이어도 되지만, 추가로 표적 유전자의 근방 영역을 포함한 영역이어도 된다. 본 발명에서 대상이 되는 생물 또는 세포는 해당 생물 또는 세포에서의 게놈 중의 GC 함량이 높은 한 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 GC 함량이 높다는 것은 게놈 중에서의 G 및 C의 비율이 65% 이상인 것으로, 68% 이상이어도 되고, 70% 이상이어도 되고, 72% 이상이어도 된다. 대상이 되는 생물 또는 세포는 예를 들면 게놈 중에 상기 II형 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 가지지 않는 진핵생물 또는 원핵생물이다. 게놈 중의 GC 함량이 높은 생물로서 예를 들면 방선균을 들 수 있고, 본 발명의 게놈 편집 방법에 적합하게 이용할 수 있다. 방선균은 본 발명에 의해 게놈 편집에 제공할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 게놈 중에 PacI의 인식 서열을 가지지 않는 방선균인 것이 바람직하다. 방선균으로서는 예를 들면 Streptomyces속, Saccharopolyspora속 및 Amycolaptosis속으로 이루어진 군에서 선택되는 방선균을 이용할 수 있다. Streptomyces속에 속하는 균으로서는 예를 들면 Streptomyces fradiae, Streptomyces venezuelae, Streptomyces griseus, Streptomyces albulus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces avermitilis 등을 들 수 있다. Saccharopolyspora속에 속하는 균으로서는 예를 들면 Saccharopolyspora spinosa 등을 들 수 있다. Amycolaptosis속에 속하는 균으로서는 예를 들면 Amycolatopsis orientalis 등을 들 수 있다. 예를 들면, II형 제한 엔도뉴클레아제로서 후술하는 PacI를 이용하는 경우에는 대상이 되는 생물 또는 세포는 그 게놈 중에 PacI