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KR-20260061154-A - 크로마토그래피 담체 및 항체의 정제 방법

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Abstract

일 실시형태에 의하면, 다공성 입자를 포함하는 베이스 담체와, 해당 베이스 담체에 고정화된 리간드를 포함하고, 상기 리간드는 하기 식(1)로 표시되거나, 또는 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 혹은 그 염이며, -NH-Z-X (1)(식(1) 중, Z는 2가의 소수성기를 나타내고; X는 NH 2 를 나타내거나, 또는 질소 원자를 포함하는 복소환기를 나타낸다). 상기 리간드는, 해당 리간드에 대해 반응성을 갖는 1종류 이상의 활성기를 통하여 상기 베이스 담체에 고정화되어 있는 크로마토그래피 담체가 제공된다.

Inventors

  • 모리 치구사
  • 이와모토 에리

Assignees

  • 제이엔씨 주식회사

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240828
Priority Date
20230831

Claims (13)

  1. 다공성 입자를 포함하는 베이스 담체와, 해당 베이스 담체에 고정화된 리간드를 포함하고, 상기 리간드는 하기 식(1)로 표시되거나, 또는 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 혹은 그 염이며, -NH-Z-X (1) (식(1) 중, Z는 2가의 소수성기를 나타내고; X는 NH 2 를 나타내거나, 또는 질소 원자를 포함하는 복소환기를 나타낸다) 상기 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 혹은 그 염은, 하기 식(2)로 표시되는 구성단위와 하기 식(3) 또는 식(3a)로 표시되는 구성단위를 포함하고, 중량평균 분자량은 1000 내지 500000이며, [화학식 1] [식(3) 및 (3a) 중, Y는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 아릴기, -COR 2 , 및 -COOR 2 로 이루어진 군에서 선택된다(여기서, R 2 는 알킬기, 아릴기, 아미노기, 또는 알콕시기이다)] 상기 리간드는, 해당 리간드에 대해 반응성을 갖는 1종류 이상의 활성기를 통하여 상기 베이스 담체에 고정화되어 있는, 크로마토그래피 담체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 리간드는 상기 식(1)로 표시되는, 크로마토그래피 담체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 식(1)에서의 Z는 알킬렌기, 시클로알킬렌기, -NR-, -O-, 아릴렌기, -S- 또는 이들의 조합을 나타내고, 이들은 각각 치환기를 갖고 있어도 되는(여기서, R은 수소 원자, 알킬기, 아릴기, 알킬에스테르기, 아릴에스테르기, 알킬에테르기 또는 아릴에테르기를 나타낸다), 크로마토그래피 담체.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 식(1)에서의 Z는 탄소수 2 ~ 12의 알킬렌기, 탄소수 3 ~ 6의 시클로알킬렌기, -O-, 페닐렌기 또는 이들의 조합을 나타내는, 크로마토그래피 담체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 리간드는, 상기 식(2)로 표시되는 구성단위와 상기 식(3)으로 표시되는 구성단위를 포함하는 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민이며, 상기 식(3)에서, Y는 한쪽이 탄소수 1 ~ 12의 알킬기, 페닐기, 또는 -COR 2 이고(여기서, R 2 는 탄소수 1 ~ 12의 알킬기 또는 페닐기이다), 다른 쪽이 수소 원자인, 크로마토그래피 담체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 리간드는 1,2-디아미노에탄, 1,3-디아미노프로판, 1,4-디아미노부탄, 2-메틸-1,3-프로판디아민, 1,5-디아미노펜탄, 1,3-디아미노펜탄, 1,6-디아미노헥산, 3,3'-디아미노디프로필아민, 3,3'-디아미노-N-메틸디프로필아민, 2-메틸-1,5-디아미노펜탄, 1,4-디아미노시클로헥산, 1,7-디아미노헵탄, 1,8-디아미노옥탄, 4-(2-아미노에틸)시클로헥실아민, 1,9-디아미노노난, 1,10-디아미노데칸, 1,4-부탄디올-비스(이소프로필아민), 1,11-디아미노운데칸, 1,12-디아미노도데칸, N,N-비스(3-아미노프로필)1,4-부탄디아민, 6,6'-디아미노디헥실아민, p-크실릴렌디아민, 4-피콜릴아민, 및 하기 식(2')로 표시되는 구성단위와 하기 식(3')로 표시되는 구성단위를 포함하는 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 [화학식 2] 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물에 유래하는 기를 포함하는, 크로마토그래피 담체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성기는 에폭시기, 포르밀기 및 비닐술폰기로 이루어진 군에서 선택되는, 크로마토그래피 담체.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 입자는 가교 셀룰로오스인, 크로마토그래피 담체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 입자의 평균 세공경은 200nm 이상인, 크로마토그래피 담체.
  10. 항체 및 숙주 유래 단백질(HCP)을 포함하는 용액을 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 크로마토그래피 담체에 접촉시켜 HCP 함량이 감소한 항체용액을 얻는 공정을 포함하는, 항체의 정제 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 항체 및 숙주 유래 단백질(HCP)을 포함하는 용액을 크로마토그래피 담체에 접촉시키는 상기 공정은, 상기 크로마토그래피 담체를 포함하는 용기에 플로우스루 모드로 상기 용액을 통과시킴으로써 수행되는, 방법.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인, 방법.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체용액에서의 HCP 함량은 300ppm 이하인, 방법.

Description

크로마토그래피 담체 및 항체의 정제 방법 본 발명은, 크로마토그래피 담체 및 그것을 이용한 항체의 정제 방법에 관한 것이다. 크로마토그래피 기술을 이용하여 바이오 의약품의 정제를 수행하는 것은 널리 알려져 있고, 여러 가지의 분자간 상호작용을 이용하여 목적물과 불순물의 분리가 이루어진다. 예로서, 정전적 상호작용을 이용한 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 항체에 대한 어피니티 상호작용을 이용한 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피 등이 있다. 바이오 의약품의 정제에서 가장 많이 이용되고 있는 것은 이온교환 크로마토그래피이다. 이온교환 크로마토그래피는, 처리액의 전기 전도도가 높은 시료에서는 흡착처리를 수행하기 전에 희석이나 탈염에 의해 전기 전도도를 예를 들어 5mS/cm까지 내릴 필요가 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피 다음으로 많이 이용되고 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 단백질 등을 흡착하기 위해 흡착 완충액 중에 고농도의 황산암모늄이나 황산나트륨을 예를 들어 2.0몰/리터 정도 함유시킬 필요가 있다. 따라서, 다량의 배양액을 처리하기 위해서는 다량의 염을 필요로 하여 제조 비용을 올리는 요인이 된다. 이러한 이온교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 결점을 보충하기 위해, 최근에는 상이한 원리로 상호작용할 수 있는 2종류 이상의 리간드를 동일한 베이스 담체에 도입한 멀티모달 크로마토그래피 담체의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 멀티모달 크로마토그래피 담체는, 이온교환기만, 또는 소수성기만을 갖는 리간드를 담지한 크로마토그래피 담체와는 다른 선택성을 나타낸다. 예를 들면, 음이온교환기와 방향족기를 갖는 담체를 플로우스루 모드로 사용하여 항체를 정제하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1). 또한, 제1급 아미노기의 일부가 소수기로 변형된(modified) 담체를 이용하여 항체를 정제하는 방법도 알려져 있다(특허문헌 2). 나아가, 음이온교환기와 알킬기와 아릴기 또는 헤테로아릴기를 포함하는 리간드가 스페이서를 통하여 베이스 담체에 결합하여 이루어진 크로마토그래피 담체를 이용하여 생체 분자를 정제하는 방법도 알려져 있다(특허문헌 3). 특히, 아미노기와 소수기를 갖는 크로마토그래피 담체가 고도전율의 조건에서 단백질을 흡착한다는 지견이 있다(비특허문헌 1). 그러나, 종래의 멀티모달 크로마토그래피 담체는, 목적 단백질(예를 들면 항체)과 불순물 단백질(예를 들면 HCP)의 분리 특성이 충분하지 않은 경우가 있고, 불순물 단백질과 동시에 목적 단백질도 흡착한다는 문제가 있었다. 그 결과, 높은 회수율로 목적 단백질을 얻는 것이 어려웠다. [선행기술문헌] [특허문헌] 특허문헌 1: 일본특허 제5064225호 공보 특허문헌 2: 국제공개 제2018/092691호 특허문헌 3: 국제공개 제2021/046284호 [비특허문헌] 비특허문헌 1: Journal of Chromatography A, 1016(2003), 21-33 이하, 본 발명의 실시형태에 대해 상세하게 설명한다. 또, 이하에 설명하는 재료, 구성 등은 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 본 발명의 취지의 범위 내에서 여러 가지 개변(改變)할 수 있는 것이다. 1. 정의 본 명세서의 용어는, 이하에서 특별히 정의되지 않는 한, 해당 기술분야에서 당업자에게 일반적으로 사용되고 있는 의미로 사용된다. 본 명세서에서, 「Tris」란 트리스히드록시메틸아미노메탄을 가리킨다. 본 명세서에서, 예를 들면 「20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)+NaCl(6mS/cm)」이라고 기재한 경우, 용액 1L당 2.42g(20mM)의 트리스히드록시메틸아미노메탄이 용해되어 있고, 염산(HCl)으로 pH 7.0으로 조정하고, 염화나트륨(NaCl)으로 전기 전도도 6mS/cm로 조정한 용액을 가리킨다. 본 명세서에서,「항체」란, 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 하나의 항원 인식 부위에 의해, 예를 들면 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 폴리펩티드 등의 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 항체는 그대로의(예를 들면 전장(全長)) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 그 항원 결합성 프래그먼트(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등), 단일쇄(scFv), 그 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 이특이성(二特異性) 항체, 선형 항체, 단일쇄 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체), 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형 항체를 포함하는, 필요로 하는 특이성의 항원 식별부를 포함하는 면역글로불린 분자의 다른 변형 배치를 포함한다. 항체는 IgD, IgE, IgG, IgA 또는 IgM(또는 그 서브클래스) 등의 임의의 클래스의 항체를 포함하고, 항체가 어떠한 특정 클래스의 것일 필요는 없다. 면역글로불린은 중쇄(重鎖)의 불변영역의 항체 아미노산 서열에 따라 다른 클래스에 귀속시켜도 된다. 5개의 주요한 클래스의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소 타입), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2로 더욱 분류될 수 있다. 본 명세서에서,「HCP」란, 숙주 세포(Host Cell)에 유래하는 단백질(Protein)의 총칭이다. 본 명세서에서,「제거」란, 정제 전의 용액에서 목적 물질 이외의 물질을 제거하는 것을 가리킨다. 예를 들면, HCP가 제거된 상태란, HCP량이 크로마토그래피 담체 접촉 전의 용액보다 감소한 상태를 가리킨다. 이는, 예를 들어 HCP를 포함하는 용액을 크로마토그래피 담체에 접촉시키면 HCP가 크로마토그래피 담체에 유지되고, 그 결과, 회수된 용액 중의 HCP량이 감소하는 것에 의한다. 본 명세서에서,「결합 용출 모드」란, 목적 물질을 크로마토그래피 담체에 일단 결합시키고, 그 후, 목적 물질을 용출시켜 회수하는 정제 방법을 말한다. 예를 들면, 항체를 정제하는 경우, 우선, 항체를 크로마토그래피 담체에 결합시키고, 불순물은 크로마토그래피 담체에 결합하지 않고 컬럼 중을 통과시킨다. 다음으로, 적절한 염농도 또는 pH를 갖는 이동상을 사용하여 크로마토그래피 담체에 결합한 항체를 이동상으로 용출시켜 회수한다. 용출 방법으로서는, 항체와 크로마토그래피 담체의 친화성이 저하되는 것과 같은 특정 염농도 또는 pH를 갖는 완충액을 통액하여 용출시키는 일단계 용출법, 단계적으로 염농도 또는 pH를 변화시켜 항체를 용출시키는 스텝와이즈법, 또는 연속적으로 염농도 또는 pH를 변화시켜 항체를 용출시키는 그래디언트법을 들 수 있다. 본 명세서에서,「플로우스루 모드」란, 불순물을 크로마토그래피 담체에 결합시키고, 목적 물질은 크로마토그래피 담체에 결합하지 않고 흘러 회수되는 정제 방법을 말한다. 예를 들면, 목적 물질이 항체이고, 불순물이 숙주 유래 단백질(HCP)인 경우, HCP가 크로마토그래피 담체에 결합하고, 항체는 크로마토그래피 담체에 결합하지 않고 컬럼 중을 흐른다. 이 때, 소량이라면 항체도 크로마토그래피 담체에 결합해도 되지만, HCP가 보다 선택적으로 크로마토그래피 담체에 결합함으로써 항체가 정제된다. 2. 크로마토그래피 담체 본 발명의 일 실시형태에 관한 크로마토그래피 담체는, 다공성 입자를 포함하는 베이스 담체와, 해당 베이스 담체에 고정화된 리간드를 포함하고, 리간드는 하기 식(1)로 표시되고, -NH-Z-X (1) (식 중, Z는 2가의 소수성기를 나타내고; X는 NH2를 나타내거나, 또는 질소 원자를 포함하는 복소환기를 나타낸다) 리간드는, 해당 리간드에 대해 반응성을 갖는 1종류 이상의 활성기를 통하여 베이스 담체에 고정화되어 있다. 혹은, 다른 실시형태에서, 상기 리간드는 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 혹은 그 염이어도 된다. 일부의 아미노기가 변형된 폴리알릴아민 혹은 그 염은, 하기 식(2)로 표시되는 구성단위와 하기 식(3) 또는 식(3a)로 표시되는 구성단위를 포함하고, 중량평균 분자량은 1000 내지 500000이다. [화학식 3] [식(3) 및 (3a) 중, Y는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 아릴기, -COR2, 및 -COOR2로 이루어진 군에서 선택된다(여기서, R2는 알킬기, 아릴기, 아미노기, 또는 알콕시기이다)] 실시형태에 관한 크로마토그래피 담체는, 리간드에 소수성기와 아미노기를 갖는 멀티모달 크로마토그래피 담체로서, 목적 물질과 불순물의 분리능이 우수하다. 그 결과로서, 목적 물질을 높은 회수율, 순도로 얻을 수 있고, 바꾸어 말하면 불순물의 제거 성능이 우수하다. 상술한 바와 같은 구조의 리간드를 사용함으로써, 이러한 효과를 얻을 수 있는 이유는 확실하지 않지만, 리간드의 아미노기는 정전적 상호작용에 추가하여 수소결합을 형성할 수 있고, 또한 소수성기의 소수성 상호작용에 의해 불순물과 상호작용할 수 있다. 따라서, 복수의 상호작용으로 서로를 보충하여 불순물과 상호작용할 수 있기 때문이라고 추측된다. 목적 물질로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 항체 등의 단백질, 펩티드, 핵산, 플라스미드, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 세포외 소포 등을 들 수 있다. 항체로서는 상기에서 정의한 바와 같이 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 그 항원 결합성 프래그먼트(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등), 단일쇄(scFv), 그 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 이특이성 항체, 선형 항체, 단일쇄 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체), 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형 항체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트이다. 불순물로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 항체 응집체, 숙주 유래 단백질(HCP), 숙주 유래 DNA, 용출된 프로틴 A, 바이러스, 엔도톡신, 배지 성분, 영양소 등을 들 수 있다. 그 중에서도, HCP는 다종류의 단백질의 혼합물이며, 근년 주목받고