KR-20260061169-A - RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING L-AMINO ACID, CONSTRUCTION METHOD THEREFOR, AND APPLICATION THEREOF

Abstract

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공하며, 상기 박테리아는 SEQ ID NO:3로 표시되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고. SEQ ID NO:31로 표시되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이된다. 또한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 재조합 균주, 및 L-아미노산 생산 방법을 더 제공하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3로 표시되는 단백질을 코딩하고 그 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환되거나, SEQ ID NO:31로 표시되는 단백질을 코딩하고 그 592번째 부위 티로신은 페닐알라닌에 의해 치환되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이된다.

Inventors

• 웨이 아이잉
• 티엔 빈
• 가오 시아오항
• 멍 강
• 저우 시아오췬
• 자오 춘광
• 마 펑용
• 지아 후이핑
• 양 리펑
• 수 허우보
• 구어 시아오웨이

Assignees

• 이너 몽골리아, 에펜 바이오테크 컴퍼니 리미티드

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20201231

Priority Date

20200608

Claims (8)

1. L-라이신 또는 L-글루탐산을 생성하는 박테리아에 있어서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고; 여기에서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있어 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 592번째 부위 티로신이 페닐알라닌에 의해 치환되면서 발현이 향상되며; 상기 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum )인 것을 특징으로 하는, L-라이신 또는 L-글루탐산을 생성하는 박테리아.
2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아.
3. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하면서 점 돌연변이가 있는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:30로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아.
4. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서, SEQ ID NO:32를 포함하여 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
5. 아미노산 서열에 있어서, 상기 서열이 SEQ ID NO:32로 표시되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열.
6. 재조합 벡터에 있어서, 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
7. 재조합 균주에 있어서, 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 균주.
8. L-라이신 또는 L-글루탐산 생산 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항에 따른 박테리아 또는 제7항에 따른 재조합 균주를 배양하고 상기 배양물로부터 L-라이신 또는 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,L-라이신 또는 L-글루탐산 생산 방법.

Description

L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 {RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING L-AMINO ACID, CONSTRUCTION METHOD THEREFOR, AND APPLICATION THEREOF} 본 출원은 2020년 10월 15일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202011105063.5이고, 발명의 명칭이 "L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원, 2020년 8월 7일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202010790887.4이고, 발명의 명칭이 "L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원, 2020년 6월 8일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202010514037.1이고, 발명의 명칭이 "lysC 유전자가 변형된 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원에 대한 우선권을 주장한다. 상기 세 가지 선행 출원은 전체로서 본 출원에 인용되었다. 본 발명은 유전 공학 및 미생물 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용에 관한 것이다. L-라이신(L-Lysine)은 의약, 식품, 사료 등 다양한 측면에서 적용 범위가 광범위하며, 그 중 사료 첨가제에 사용되는 L-라이신이 전체의 90% 이상을 차지한다. 현재 중국은 L-라이신의 두 번째로 큰 소비 시장이자 L-라이신의 최대 생산국이다. 현재 L-라이신은 주로 직접 발효법으로 생산되고 있으며 직접발효법은 L-라이신 생합성 경로가 완전한 균주를 사용하며, 폐당밀, 전분 가수분해물 등을 기질로 하여 호기성 발효를 통해 생산한다. 해당 방법은 오늘날 전 세계 L-라이신 생산량의 2/3를 차지하고 있으며 공정이 매우 성숙하여 주로 효모, 박테리아, 곰팡이에 존재하며 미생물에 광범위하게 존재한다. 현재, 산업계에서 L-라이신 발효에 사용되는 생산 균종은 주로 코리네박테리움과 브레비박테리움속의 돌연변이 육종 돌연변이 균주이다. 대사 공학과 유전 공학의 발달로 유전자 변이를 제어할 수 있게 됨에 따라, 대사 공학을 이용하여 출발 균주를 형질전환하는 과정에서, 대사 과정 중 L-라이신 생산의 핵심 효소 유전자를 정확히 찾아낸 후, 주요 효소 유전자의 발현을 증가시키고 L-라이신 생산의 개선을 구현할 수 있다. L-글루탐산은 주로 글루타민산나트륨, 향료, 소금 대체물, 영양 보충제 및 생화학 시약의 생산에 사용된다. L-글루탐산 자체가 약으로 사용될 수 있으며, 뇌에서 단백질과 당의 대사에 참여하고 산화 과정을 촉진한다. 해당 제품은 체내에서 암모니아와 결합하여 무독성 글루타민을 형성하여 혈중 암모니아를 감소시키고 간성 혼수 증상을 완화한다. 과거에는 글루타민산나트륨의 생산이 주로 밀 글루텐(글루텐 단백질)의 가수분해에 의해 이루어졌으나 현재는 미생물 발효에 의한 대규모 생산에 이용되고 있다. 이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 해결책을 보다 상세하게 설명한다. 이하에 나열된 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하고 해석하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것으로 해석할 수 없는 점에 유의한다. 본 발명의 상기 내용으로 구현되는 기술은 모두 본 발명에서 보호하고자 하는 범위 내에 속한다. 달리 명시되지 않는 한, 이하의 실시예에 사용된 원료 및 시약은 모두 시판되는 제품이거나, 공지된 방법으로 제조할 수 있으며, 수행된 조작은 모두 당업계에 공지된 것이거나 시판되는 제품의 사용자 지침에 따라 수행할 수 있는 것이다. 하기 실시예에서 배양에 사용된 균주에 사용된 기본 배지는 성분이 동일하며, 해당 기본 배지 성분 상에 상응하는 필요한 수크로스, 카나마이신 또는 클로람페니콜 등을 첨가한다. 기본 배지는 다음과 같이 구성된다. 하기 실시예에서 SSCP 전기영동 PAGE의 제조 및 조건은 다음과 같다. 하기 실시예에서, L-라이신의 발효 배지 및 발효 공정은 표 1 및 2와 같다. 표 1 L-라이신 발효 배지 배합 표 2 L-라이신의 발효 제어 공정 하기 실시예에서, L-글루탐산의 발효 배지 및 발효 공정은 표 3 및 4와 같다. 표 3 L-글루탐산 발효 배지 배합 표 4 L-글루탐산의 발효 제어 공정 실시예 1 점 돌연변이된 NCgl0609 유전자 코딩 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pk18-NCgl0609R334*의 구축 NCBI에서 공표한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, NCgl0609 유전자 코딩 영역을 증폭하기 위한 2쌍의 프라이머를 설계 및 합성하였으며, 대립유전자 치환 방식으로 균주 YP97158[기탁번호: CGMCC No.12856, 기탁일자: 2016년 8월 16일, 기탁장소: 중국과학원미생물학연구소, 베이징 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일자 2017년 2월 1일)에 기록, 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형 NCgl0609 유전자가 남아 있음을 확인] 배경에 NCgl0609 유전자 코딩 영역(SEQ ID NO:1, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3)에 점 돌연변이를 도입하고, NCgl0609 유전자의 뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 C가 T(SEQ ID NO:2)로 변경되고, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터(SEQ ID NO:4, NCgl0609R334*)로 변경되었다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성). P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGACGGCAAC GTACATAAC3'(SEQ ID NO:5) P2: 5' GTTGCCGGTGAGTCAAACAGTCATTTTGC 3' (SEQ ID NO:6) P3: 5' GCAAAATGACTGTTTGACTCACCGGCAAC 3' (SEQ ID NO:7) P4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCGGCTG GAA ATGTGGAG3' (SEQ ID NO:8) 구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P1 및 P2, P3 및 P4로 PCR 증폭을 수행한다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 다음과 같은 방식으로 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, (94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장, 30사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장하여 크기가 각각 698bp 및 648bp이고, NCgl0609 유전자 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl0609 Up과 NCgl0609 Down)을 획득한다. 상기 2개의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 다시 상기 2개의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하고, P1 및 P4를 프라이머로 사용하여, Overlap PCR을 통해 길이 1317bp의 단편으로 증폭하였다. PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, (94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장, 30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다. 이 DNA 단편은 YP97158 NCgl0609 유전자 코딩 영역의 1000번째 부위의 사이토신(C)을 타이민(T)으로 변경시키며, 최종적으로 코딩 단백질의 334번째 부위 아미노산이 아르기닌(R)에서 터미네이터로 변경된다. 이 DNA 단편은 아가로스 겔 전기영동 후 정제를 수행하며, 이중 분해 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구매, 각각 Xbal I/BamH I 이중 분해 사용)와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구매)로 50℃에서 30분 동안 연결하며, 연결 생성물은 형질전환 후 성장한 단일클론이 PCR을 거쳐 양성 벡터 pk18-NCgl0609R334*를 획득한다. 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커를 포함한다. 분해가 정확한 벡터 pk18-NCgl0609R334*를 시퀀싱사에 보내 시퀀싱 식별을 수행하고, 정확한 점 돌연변이(C-T)를 포함하는 벡터 pk18-NCgl0609R334*는 향후 사용을 위해 보관한다. 실시예 2 점 돌연변이를 포함하는 NCgl0609R334*의 조작 균주의 구축 구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pk18-NCgl0609R334*를 전기충격에 의해 L-라이신 생산균주 YP97158로 형질전환하였다(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형 NCgl0609 유전자 코딩 영역이 남아 있음을 확인). 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 프라이머 P1 및 범용 프라이머 M13R을 통해 동정하였으며, 1375bp 크기 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하며, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 카나마이신이 포함되는 않은 배지에서는 성장하나, 카나마이신이 포함된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 다음 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용해 PCR 동정을 추가로 수행한다. P5: 5' CTAGCCGGTTCCAGTCAG 3' (SEQ ID NO:9) P6: 5' GGACGTCTGTTCACCATTG 3' (SEQ ID NO:10) 상기 PCR 증폭 생성물 264bp는 95℃ 고온에서 10분 동안 변성시키고, 5분 동안 얼음욕에서 처리한 후 sscp 전기영동(플라스미드 pk18-NC