KR-20260061173-A - 재조합 인간화 III형 삼중 나선 콜라겐 및 이의 제조 방법과 응용

Abstract

재조합 인간화 III형 삼중 나선 콜라겐의 응용 및 이의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 재조합 콜라겐 단량체를 제공한다. 상기 재조합 콜라겐 단량체는 적어도 하나의 콜라겐 활성 단편을 포함하고, 상기 콜라겐 활성 단편은 적어도 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하며, 3개의 부착 부위는 동일하거나 상이하고, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 168번째 아미노산 내지 1196번째 아미노산으로부터 유래된다.

Inventors

• 친 수어푸
• 쉬 천
• 덩 페이옌
• 루 하이펑
• 상 웨이
• 인 지앙펑
• 황 후이위
• 저우 신롱

Assignees

• 커싱 메디컬 디바이스 컴퍼니 리미티드

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20240301

Priority Date

20230828

Claims (20)

1. 재조합 콜라겐 단량체에 있어서, 적어도 하나의 콜라겐 활성 단편을 포함하고, 상기 콜라겐 활성 단편은 적어도 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 168번째 아미노산 내지 1196번째 아미노산으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
3. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하고, 상기 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위는 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
4. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 1089번째 아미노산 내지 1172번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 234번째 아미노산 내지 296번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 273번째 아미노산 내지 311번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 288번째 아미노산 내지 452번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 300번째 아미노산 내지 485번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 444번째 아미노산 내지 503번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 483번째 아미노산 내지 512번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 501번째 아미노산 내지 599번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 507번째 아미노산 내지 686번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 591번째 아미노산 내지 731번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 678번째 아미노산 내지 806번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 726번째 아미노산 내지 830번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 795번째 아미노산 내지 833번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 798번째 아미노산 내지 839번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 852번째 아미노산 내지 866번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 828번째 아미노산 내지 932번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 861번째 아미노산 내지 995번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 927번째 아미노산 내지 1094번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 987번째 아미노산 내지 1103번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트인 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
5. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
6. 제1항에 있어서, 2개 내지 12개의 콜라겐 활성 단편을 포함하고, 상기 콜라겐 활성 단편은 동일하거나 상이하며, 상기 2개 내지 12개의 콜라겐 활성 단편은 서로 직접 또는 간접적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
7. 제6항에 있어서, 6개의 콜라겐 활성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
8. 제1항에 있어서, 안정화 서열을 더 포함하고, 상기 안정화 서열은 상기 적어도 하나의 콜라겐 활성 단편의 C말단과 연결되며, 상기 안정화 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6인 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
9. 제1항에 있어서, 상기 재조합 콜라겐 단량체는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐 단량체.
10. 재조합 콜라겐에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 콜라겐 단량체 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐.
11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 콜라겐은 삼중 나선 구조를 갖고, 상기 재조합 콜라겐 단량체는 동종 또는 이종이며, 상기 재조합 콜라겐 단량체 사이는 수소 결합 또는 정전기력에 의해 서로 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 콜라겐.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 콜라겐 단량체 또는 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 콜라겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
13. 제12항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
14. 재조합 세포에 있어서, 제12항에 따른 핵산 분자, 제13항에 따른 벡터를 포함하거나 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 콜라겐 단량체 또는 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 콜라겐을 발현하며, 상기 재조합 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이고, 상기 진핵 세포는 피키아 효모, 사카로미세스 세레비시애, 동물 세포 또는 식물 세포이며, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균 또는 바실러스 리체니포미스인 것을 특징으로 하는, 재조합 세포.
15. 재조합 콜라겐을 제조하는 방법에 있어서, 제14항에 따른 재조합 세포를 단백질 발현에 적합한 조건에서 배양 처리하여 상기 재조합 콜라겐을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
16. 약물 제조에서 시약의 용도에 있어서, 상기 약물은 콜라겐의 활성을 향상시키거나 콜라겐 발현 또는 분비를 촉진하는 데 사용되고, 상기 시약은 콜라겐 활성 단편을 활성화하는 데 사용되고, 상기 콜라겐 활성 단편은 적어도 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
17. 약물 제조에서 시약의 용도에 있어서, 상기 약물은 콜라겐의 활성을 억제하거나 콜라겐 발현 또는 분비를 억제하는 데 사용되고, 상기 시약은 콜라겐 활성 단편을 억제하는 데 사용되고, 상기 콜라겐 활성 단편은 적어도 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 168번째 아미노산 내지 1196번째 아미노산으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 용도.
19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 3개의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 1089번째 아미노산 내지 1172번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 234번째 아미노산 내지 296번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 273번째 아미노산 내지 311번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 288번째 아미노산 내지 452번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 300번째 아미노산 내지 485번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 444번째 아미노산 내지 503번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 483번째 아미노산 내지 512번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 501번째 아미노산 내지 599번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 507번째 아미노산 내지 686번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 591번째 아미노산 내지 731번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 678번째 아미노산 내지 806번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 726번째 아미노산 내지 830번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 795번째 아미노산 내지 833번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 798번째 아미노산 내지 839번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 852번째 아미노산 내지 866번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 828번째 아미노산 내지 932번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 861번째 아미노산 내지 995번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 927번째 아미노산 내지 1094번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트 및/또는 987번째 아미노산 내지 1103번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트인 것을 특징으로 하는, 용도.

Description

재조합 인간화 III형 삼중 나선 콜라겐 및 이의 제조 방법과 응용 본 출원은 2023년 08월 28일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호 2023110945209의 특허출원의 우선권과 권익을 주장하며, 참조를 통해 그 전문을 본 명세서에 인용하였다. 본 발명은 바이오 기술 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 재조합 인간화 III형 삼중 나선 콜라겐 및 이의 제조 방법과 응용에 관한 것이다. 천연 콜라겐 단백질(천연 콜라겐)은 생물체 내 함량이 가장 높은 고분자 단백질로, 총 단백질량의 약 20 내지 30%를 차지한다. 현재 발견된 약 28종의 천연 콜라겐은 피부, 골격, 건 및 각종 장기의 결합조직에 광범위하게 분포되어 있으며, 상처 복구, 피부 노화, 혈액 응고, 관절 윤활 등 다양한 생명 활동에 참여한다. 중요한 생물 재료로서, 콜라겐은 의학, 미용, 식품 공업 등 분야에서 광범위한 응용 가치를 갖는다. 천연 I형 및 III형 콜라겐은 복잡한 다층 구조를 갖는 섬유상 콜라겐이다. 분자량이 비교적 크고, 분자 중 나선 영역 도메인의 아미노산 배열 순서는 Gly-X-Y 반복 서열이며, 일반적으로 Y는 수산화 프롤린이고, 3개의 동종 또는 이종 단백질 분자는 수소 결합, 정전기력 등 분자 간 작용력에 의해 삼중 나선 구조로 배열되며, 나아가 적층 배열되어 더 고급의 섬유 구조를 이룬다. 현재 시장의 콜라겐 공급원은 주로 돼지, 소 및 어류 제품 등 동물이며, 동물 유래 콜라겐은 주로 산, 알칼리 가수분해 및 효소 분해 추출 공정을 통해 가공 추출된다. 그러나 동물 추출 콜라겐은 다음과 같은 단점이 있다. 1) 동물 유래 콜라겐과 인간 유래 콜라겐은 아미노산 서열 차이가 존재하여 면역원성이 있어 알레르기 반응 위험이 존재한다. 2) 동물 유래 콜라겐은 광우병 프리온 등 바이러스를 함유할 수 있다. 3) 공정 추출 과정에서 콜라겐 구조가 일정 정도 파괴되어 원래의 생물학적 활성이 약화된다. 4) 종교 윤리 문제가 존재한다. 따라서, 전술한 존재하는 문제를 극복하기 위한 새로운 유형의 콜라겐 제조 방법을 개발하는 것이 시급하다. 본 발명의 전술한 및/또는 추가적인 측면과 장점은 하기 도면과 결합한 실시예의 설명으로부터 명백해지고 쉽게 이해될 수 있다. 도 1은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109 원액의 겔 전기영동도이다. 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109의 질량 분석 분자량 동정 디콘볼루션도이다. 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109의 20℃에서의 원편광 이색성 스펙트럼 곡선도이다. 도 4는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109의 상이한 온도에서 221nm 파장에서의 원편광 이색성 타원률 산점도이다. 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109의 항트립신 효소 절단 단백질 겔 전기영동도이다(여기에서 WYM은 시판 동종 제품을 가리킴). 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 상이한 단편의 NIH3T3 세포 부착성 테스트 결과도이다. 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 상이한 반복수 단편의 NIH3T3 세포 부착성 테스트 결과도이다. 도 8은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 콜라겐 Y109의 일정 농도 범위 내에서 NIH/3T3 세포 부착 활성에 대한 영향 결과도이다. 이하에서는 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 아래 설명되는 실시예는 예시적인 것으로, 단지 본 발명을 해석하기 위한 것이며, 본 발명에 대한 제한으로 이해되어서는 안 된다. 정의 및 설명 별도의 설명이 없거나 문맥상 명백한 충돌이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 관사 "일", "하나(의)" 및 "상기"는 "적어도 하나" 또는 "하나 또는 복수"를 포함하는 것을 의도한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 이러한 관사는 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)의 목적어의 관사를 가리킨다. 예를 들어, "일 성분"은 하나 이상의 성분을 가리키며, 즉 하나 이상의 성분이 상기 실시방안의 실시방식에서 채택되거나 사용되는 것으로 고려될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "포함하다" 또는 "포괄하다"는 개방형 표현으로, 즉 본 발명이 지적하는 내용을 포함하되, 다른 측면의 내용을 배제하지 않는다. 본 명세서에서, 용어 "임의로", "임의의" 또는 "임의"는 통상적으로 후술하는 사건 또는 상황이 발생할 수 있으나 반드시 발생하는 것은 아니며, 상기 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 상기 사건 또는 상황이 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 재조합 콜라겐 단량체, 재조합 콜라겐 및 이의 용도, 핵산 분자, 벡터, 재조합 세포와 재조합 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하며, 아래에서 각각에 대해 상세히 설명한다. 재조합 콜라겐 단량체 본 발명의 일 양상에서, 본 발명은 재조합 콜라겐 단량체를 제공하며, 상기 재조합 콜라겐 단량체는 적어도 하나의 콜라겐 활성 단편을 포함하고, 상기 콜라겐 활성 단편은 적어도 3개의 동일하거나 상이한 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위를 포함한다. 여기에서, 본 발명에서 상기 "콜라겐 활성 단편"은 콜라겐(SEQ ID NO: 1) "168번째 아미노산 내지 1196번째 아미노산" 사이로부터 유래하는 펩티드 세그먼트를 가리키며, 즉 GER 부위, GEK 부위 펩티드 세그먼트, RGD 부위, GEN 부위도 이 구간의 펩티드 세그먼트로부터 유래되며, 여기에서 복수의 GER 부위 및/또는 GEK 부위 및/또는 RGD 부위 및/또는 GEN 부위는 연속적일 수도 있고 불연속적일 수도 있다. 유의할 점은, 본 발명에서 상기 "콜라겐"은 천연 인간 III형 콜라겐이며, 그 전장 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이라는 것이다. 또한 상기 "168번째 아미노산 내지 1196번째 아미노산"은 천연 인간 III형 콜라겐의 168번째 아미노산 서열 내지 1196번째 아미노산 서열을 가리키며, 즉 성숙 인간 III형 콜라겐 나선 영역이다. MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPQPPTAPTRPPNGQGPQGPKGDPGPPGIPGRNGDPGIPGQPGSPGSPGPPGICESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGRPGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGVPGGPGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGPPGSNGNPGPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVQLAFLRLLSSRASQNITYHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL(SEQ ID NO: 1) 본 발명의 바람직한 일 실시방안에서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 1089번째 아미노산 내지 1172번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트이며, SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열에 대응하고, 즉 본 발명 실시예에서 상기 019 펩티드 세그먼트이다. 이 구간 내의 콜라겐 활성 단편의 부착 활성이 가장 높다. 본 발명의 바람직한 일 실시방안에서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 234번째 아미노산 내지 296번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트이며, SEQ ID NO: 7로 표시되는 서열에 대응하고, 즉 본 발명 실시예에서 상기 001 펩티드 세그먼트이다. 본 발명의 바람직한 일 실시방안에서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 273번째 아미노산 내지 311번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트이며, SEQ ID NO: 8로 표시되는 서열에 대응하고, 즉 본 발명 실시예에서 상기 002 펩티드 세그먼트이다. 본 발명의 바람직한 일 실시방안에서, 상기 콜라겐 활성 단편은 콜라겐의 288번째 아미노산 내지 452번째 아미노산 사이의 펩티드 세그먼트이며, SEQ ID NO: 9로 표시되는 서열에 대응하고, 즉 본