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KR-20260061187-A - IdeZ 개변체

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Abstract

일 실시형태에 의하면, IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 IdeZ 개변체로서, (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 35위부터 349위까지의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 서열을 포함하고; 또한 (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 118위에 대응하는 위치 및 267위에 대응하는 위치의 아미노산에 당쇄가 부가되어 있지 않는 IdeZ 개변체가 제공된다.

Inventors

  • 이와사키 마사시
  • 야마주쿠 다이스케
  • 야마자키 리카
  • 도미모토 유스케
  • 시라이 히로키

Assignees

  • 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240829
Priority Date
20230830

Claims (20)

  1. IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 IdeZ 개변체로서, 해당 개변체는, (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 35위부터 349위까지의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 서열을 포함하고; 또한 (b) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 118위에 대응하는 위치 및 267위에 대응하는 위치의 아미노산에 당쇄가 부가되어 있지 않는 IdeZ 개변체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 이하의 (b') 및 (b'')의 아미노산 개변을 포함하는, IdeZ 개변체: (b') (i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 118위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (ii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 119위에 대응하는 위치의 아미노산이, 프롤린으로 치환되어 있다; 및/또는 (iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 120위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파라긴, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (b'') (i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (ii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 268위에 대응하는 위치의 아미노산이, 프롤린으로 치환되어 있다; 및/또는 (iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파라긴, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 120위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루탐산으로 치환되어 있고, 및 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 아르기닌으로 치환되어 있는, IdeZ 개변체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, (c) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 171위에 대응하는 위치의 아미노산에 당쇄가 부가되어 있지 않고, 및/또는 (d) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 298위에 대응하는 위치의 아미노산에 당쇄가 부가되어 있지 않는, IdeZ 개변체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 이하의 (c') 및/또는 (d')의 아미노산 개변을 포함하는, IdeZ 개변체: (c') (i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 171위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (ii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 172위에 대응하는 위치의 아미노산이, 프롤린으로 치환되어 있다; 및/또는 (iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 173위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파라긴, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (d') (i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 298위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다; (ii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 299위에 대응하는 위치의 아미노산이, 프롤린으로 치환되어 있다; 및/또는 (iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 300위에 대응하는 위치의 아미노산이, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 시스테인, 아이소류신, 류신, 아스파라긴, 아스파트산, 글루타민, 리신, 글루탐산, 메티오닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되어 있다.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 171위에 대응하는 위치의 아미노산이 글리신으로 치환되어 있고, 및/또는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 298위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파트산으로 치환되어 있는, IdeZ 개변체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 120위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루탐산으로 치환되어 있고, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 171위에 대응하는 위치의 아미노산이 글리신으로 치환되어 있고, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 아르기닌으로 치환되어 있고, 또한 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 298위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파트산으로 치환되어 있는, IdeZ 개변체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 IdeZ 개변체는, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, IdeZ 개변체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 IdeZ 개변체를 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가, 상기 IdeZ 개변체와 Fc 영역의 융합 단백질인, 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG에서 유래하는, 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 Fc 영역이, 인간 Igγ1, 인간 Igγ2, 인간 Igγ3, 또는 인간 Igγ4에서 유래하는, 폴리펩타이드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 236위가 글루탐산으로 치환되어 있고, 또한 237위가 발린으로 치환되어 있는 (여기에서, 아미노산 잔기 번호는, EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다) 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 추가로 234위가 알라닌으로 치환되어 있고, 또한 235위가 글루탐산으로 치환되어 있는, 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 추가로 227위가 히스티딘으로 치환되어 있고, 228위가 리신으로 치환되어 있고, 233위가 아스파라긴으로 치환되어 있고, 및/또는 238위가 세린으로 치환되어 있는, 폴리펩타이드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 추가로 253위가 알라닌으로 치환되어 있고, 293위 또는 294위가 결실되어 있고, 및/또는 296위가 알라닌으로 치환되어 있는, 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 하기 (1) 및 (2)로부터 선택되는, 폴리펩타이드; (1) 234위가 알라닌으로 치환되어 있고, 235위가 글루탐산으로 치환되어 있고, 236위가 글루탐산으로 치환되어 있고, 237위가 발린으로 치환되어 있고, 253위가 알라닌으로 치환되어 있고, 또한 293위 또는 294위가 결실되어 있는 Fc 영역; (2) 227위가 히스티딘으로 치환되어 있고, 228위가 리신으로 치환되어 있고, 233위가 아스파라긴으로 치환되어 있고, 234위가 알라닌으로 치환되어 있고, 235위가 글루탐산으로 치환되어 있고, 236위가 글루탐산으로 치환되어 있고, 237위가 발린으로 치환되어 있고, 238위가 세린으로 치환되어 있고, 253위가 알라닌으로 치환되어 있고, 또한 293위 또는 294위가 결실되어 있는 Fc 영역.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Fc 영역은, 서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 316위부터 541위까지의 아미노산으로 이루어지는 서열, 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 316위부터 541위까지의 아미노산으로 이루어지는 서열, 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 316위부터 541위까지의 아미노산으로 이루어지는 서열, 또는 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 316위부터 541위까지의 아미노산으로 이루어지는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은, 상기 IdeZ 개변체가 상기 Fc 영역의 N 말단에 결합한 융합 단백질이고, 2본의 해당 융합 단백질이 이량체를 형성하고 있는, 폴리펩타이드.
  20. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 상기 IdeZ 개변체가 제1 Fc 영역의 N 말단에 결합한 융합 단백질, 및 상기 IdeZ 개변체가 결합하고 있지 않는 제2 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩타이드.

Description

IdeZ 개변체 본 발명은, IdeZ 개변체, 및 해당 IdeZ 개변체를 포함하는 폴리펩타이드 등에 관한 것이다. 연쇄구균에서 유래하는 IdeS는, 인간 IgG의 Fab와 Fc를 연결하는 힌지부를 서열 특이적으로 절단하는 시스테인 프로테아제이고, 높은 절단 효율과 기질 특이성을 갖고 있기 때문에, 항체 의약 후보의 특성 해석 등에 이용되고 있다. 근년, 그 용도는 확대되고 있고, 예를 들면, 고품질 재조합 단백질 생산 시스템에 있어서의 사용, 이식 시의 거절 반응이나 자기면역 질환 등에 있어서의 효과가 기대되고 있다(비특허문헌 1 및 2). 나아가서는, IdeS와 인간 Fc 영역으로 이루어지는 융합체의 연구도 이루어지고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 연쇄구균에 감염된 적이 있는 인간은 IdeS에 대한 면역을 갖고 있어, 그와 같은 인간에 IdeS를 투여하면 항약물 항체(ADA)가 산생되어 버리는 등, IdeS가 갖는 높은 항원성이 문제가 되는 경우가 있다(비특허문헌 3). IdeS가 갖는 이와 같은 과제를 해결하기 위해, 인간에 감염되지 않는 연쇄구균 유래의 IdeZ나, ADA의 산생이 억제되도록 개변된 IdeZ 개변체 등의 연구도 진행되고 있다(특허문헌 1, 2). 그리고, 그와 같은 IdeZ나 IdeZ 개변체에 대해, 추가적인 특성의 개선이 요망되고 있다. 도 1은, 실시예 1에서 제조한 각 융합 단백질의 영동상을 나타낸다(좌측 도면은 비환원 조건, 우측 도면은 환원 조건). 레인 5는 분자량 마커, 레인 7은 야생형 IdeZ-마우스 Fc 융합 단백질, 레인 9는 IdeZ 개변체 A-마우스 Fc 융합 단백질을 각각 나타낸다. 도 2는, 실시예 1에서 제조한 각 융합 단백질의 절단 활성을 나타낸다. 화살표 1은 H쇄를 나타낸다. 화살표 2는 Fab' 단편을 나타낸다. 레인 3 내지 7은, 야생형 IdeZ-마우스 Fc 융합 단백질에 대한 항체의 농도비가 각각 10, 33, 100, 333, 1000배인 경우에 있어서, 절단된 항체의 영동상을 나타낸다. 레인 8 내지 12는, IdeZ 개변체 A-마우스 Fc 융합 단백질을 사용하여 마찬가지로 시험한 경우의 항체의 영동상을 나타낸다. 레인 13은, anti-KLH_hIgG1만의 영동상을 나타낸다. 도 3은, 실시예 2에서 제조한 각 융합 단백질의 영동상을 나타낸다(좌측 도면은 비환원 조건, 우측 도면은 환원 조건). 레인 5는 IdeZ 개변체 2-마우스 Fc 융합 단백질, 레인 7은 IdeZ 개변체 3-마우스 Fc 융합 단백질, 레인 9는 IdeZ 개변체 4-마우스 Fc 융합 단백질을 각각 나타낸다. 도 4는, 실시예 2에서 제조한 각 융합 단백질의 절단 활성을 나타낸다. 화살표 1은 H쇄를 나타낸다. 화살표 2는 Fab' 단편을 나타낸다. 좌측 도면의 레인 3 내지 7은, IdeZ 개변체 2-마우스 Fc 융합 단백질에 대한 항체의 농도비가 각각 10, 33, 100, 333, 1000배인 경우에 있어서, 절단된 항체의 영동상을 나타낸다. 레인 8 내지 12는, IdeZ 개변체 3-마우스 Fc 융합 단백질을 사용하여 마찬가지로 시험한 경우의 항체의 영동상을 나타낸다. 우측 도면의 레인 3 내지 7은, IdeZ 개변체 4-마우스 Fc 융합 단백질을 사용하여 마찬가지로 시험한 경우의 항체의 영동상을 나타낸다. 도 5는, 실시예 3-1에서 제조한 각 융합 단백질의 영동상을 나타낸다(좌측 도면은 환원 조건, 우측 도면은 비환원 조건). 레인 1은 분자량 마커, 레인 2~6은 각각 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 5, 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 6, 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 9, 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 10, 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 11을 나타낸다. 도 6은, 실시예 3-2에서 제조한 각 융합 단백질의 영동상을 나타낸다(좌측 도면은 환원 조건, 우측 도면은 비환원 조건). 레인 1은 분자량 마커, 레인 2~5는 각각 비시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 7, 8, 17, 18을 나타낸다. 레인 6~9는, 각각 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 7, 8, 17, 18을 나타낸다. 도 7은, 실시예 4에서 제조한 각 융합 단백질의 영동상을 나타낸다(좌측 도면은 환원 조건, 우측 도면은 비환원 조건). 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 비시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 19, 레인 3은 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 19를 나타낸다. 도 8은, 실시예 5에서 제조한 각 융합 단백질의 절단 활성을 나타낸다. 레인 2 내지 5는, anti-KLH_hIgG1량에 대한 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 7의 종농도가 0.2, 0.04, 0.008, 0.0016배가 되도록 반응시킨 후의 영동상을 나타낸다. 레인 8 내지 11은, anti-KLH_hIgG1량에 대한 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 19의 종농도가 0.2, 0.04, 0.008, 0.0016배가 되도록 반응시킨 후의 영동상을 나타낸다. 레인 1, 14는 분자량 마커, 레인 7, 13은, anti-KLH_hIgG1, 레인 6은 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 7, 레인 12는 시알화 IdeZ 개변체 A-인간 Fc 개변체 19의 영동상을 나타낸다. 이하, 본 발명의 실시형태에 대해 상세하게 설명한다. 한편, 이하에 설명하는 재료, 구성 등은 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 본 발명의 취지의 범위 내에서 여러 가지 개변할 수 있는 것이다. 1. 정의 본 명세서의 용어는, 이하에서 특별히 정의되지 않는 한, 당해 기술 분야에서 당업자에게 일반적으로 사용되고 있는 의미로 사용된다. 본 명세서에 있어서, 「IdeZ 개변체」란, 야생형의 IdeZ(서열 번호 1)에 대해서 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는 IdeZ를 의미하고, 아미노산 개변에는, 아미노산의 치환, 부가, 결실, 삽입, 수식 등이 포함된다. 본 명세서에 있어서, 아미노산의 「개변」과 「변이」는 동일한 의미로 사용된다. 본 명세서에 있어서, 「Fc 영역 개변체」란, 야생형의 Fc 영역에 대해서 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는 Fc 영역을 의미하고, 아미노산 개변에는, 아미노산의 치환, 부가, 결실, 삽입, 수식 등이 포함된다. 본 명세서에 있어서 「Fc 영역」 또는 「Fc 영역 개변체」라는 용어를 사용하는 경우, 복수의 Fc 영역으로 이루어지는 복합체(예를 들면 다이머)도 포함하는 의도이다. 본 명세서에 있어서, 「Fc 영역(개변체)」는, 어느 항체에서 유래하는 것이어도 된다. 항체(또는 면역글로불린)란, 단일의 서열을 갖는 중쇄 2본과, 단일의 서열을 갖는 경쇄 2본으로 이루어지는 좌우 대칭 Y자형의 구조를 갖는 4본쇄 구조로 이루어지는 당단백질을 말한다. 항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는 각 클래스 공통이며, 분자량 5만~7만의 중쇄 2본과 2만~3만의 경쇄 2본이 다이설파이드 결합 및 비공유 결합에 의해 결합하여, 분자량 15만~19만의 Y자형의 4본쇄 구조로 이루어지는 항체 분자를 형성한다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 각각, Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라고 불린다. 나아가 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불린다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, L형과 K형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 한다. 상기 2종의 경쇄는, 어느 종류의 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 항체 분자의 쇄내 다이설파이드 결합은, 중쇄에는 4개(Igμ, Igε에는 5개), 경쇄에는 2개 존재하고, 아미노산 100~110잔기마다 1개의 루프를 이루고 있다. 그들의 입체 구조는 각 루프 간에서 유사하며, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두, N 말단에 위치하는 도메인은 가변 영역이라고 불리며, 동종 동물의 동일 클래스(또는 서브클래스)로부터 산생된 항체이더라도 다양한 아미노산 서열을 갖고, 항체와 항원의 결합 특이성 결합에 관여하는 것이 알려져 있다. 가변 영역보다도 하류의 C 말단 측의 도메인의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하며, 정상 영역이라고 불리고 있다. 중쇄는, N 말단으로부터 C 말단을 향해 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 정상 영역(CH)을 갖는다. CH는 N 말단 측으로부터 CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인의 3개의 도메인으로 더 나뉜다(IgG의 경우). 경쇄는, N 말단으로부터 C 말단을 향해 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 정상 영역(CL)을 갖는다. VH 및 VL에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은 변화가 매우 커, 가변 영역의 가변성에 기여하고 있다. CDR은, 중쇄와 경쇄의 N 말단 각각에 CDR1, CDR2, CDR3의 순번으로 존재하는 대략 5~10 아미노산 잔기로 이루어지는 영역으로서, 항원 결합 부위를 형성한다. 한편, 가변 영역의 CDR 이외의 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리며, FR1~4로 이루어지고, 아미노산 서열의 변화는 비교적 적다. 항체를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리하면, 3개의 항체 단편이 얻어진다. N 말단 측의 2개의 단편은 Fab(항원 결합 단편, Fragment, antigenbinding) 영역이라고 불리고, C 말단 측의 단편은 Fc(결정화 가능 단편, Fragment, crystallizable) 영역이라고 불리고 있다. 본 명세서에 있어서, 「Fc 영역」은, CH1 도메인을 제외한 항체의 정상 영역으로 이루어지는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, IgA, IgD, IgG의 Fc 영역은, C 말단 측의 마지막 2개의 중쇄 정상 영역 도메인(CH2 및 CH3)이고, IgE 및 IgM의 Fc 영역은, C 말단 측의 마지막 3개의