KR-20260061210-A - 변형 생물발광 효소

Abstract

본 명세서에는 루시퍼라제 및 진균 루시페린 생합성 효소의 하나 이상의 신규 변이체(들), 이 효소들을 암호화할 수 있는 핵산, 및 진균 루시페린 생합성의 특정 단계를 촉매할 수 있는 단백질이 제공된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 생물발광 효소, 특히 하나 이상의 히스피딘 수산화효소 및 루시퍼라제, 및 기능적 단편 및 이들을 암호화하는 핵산이 개시된다.

Inventors

• 엔셀 랜스 피.
• 홀 메리 피.
• 호앙 트리쉬 티.
• 우드 케이스 브이.
• 우드 모니카 지.
• 미신 알렉산더 에스.
• 사르키샨 카렌 에스.
• 얌폴스키 일리야 브이.

Assignees

• 라이트 바이오, 아이엔씨

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20240828

Priority Date

20240827

Claims (20)

1. 생물발광(bioluminescence)을 생성하는 방법으로서, 서열번호 1로 식별되는 아미노산 서열의 40-267번 위치와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 정의하는 루시퍼라제를 암호화하는 단리된 핵산을 제공하는 단계로서, 아미노산 서열은 T99P, T192S, A199P로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단계; 및 단리된 핵산을 3-하이드록시히스피딘을 생합성할 수 있는 형질전환 유기체(transgenic organism) 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 단리된 루시퍼라제는 아미노산 치환 T99P, T192S 및 A199P를 포함하는 아미노산 서열을 정의하는, 방법.
3. 서열번호 5로 식별되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 정의하는 단리된 히스피딘 수산화효소(hispidin hydroxylase)로서, 아미노산 서열은 D37E, V181I, A183P, S323M, M385K로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 히스피딘 수산화효소(hispidin hydroxylase).
4. 제3항에 있어서, 아미노산 서열은 아미노산 치환 D37E, V181I, S323M 및 M385K를 포함하는, 단리된 히스피딘 수산화효소.
5. 제3항 또는 제4항의 단리된 히스피딘 수산화효소를 암호화하는 핵산.
6. 제3항 또는 제4항의 단리된 히스피딘 수산화효소를 포함하는 세포 또는 유기체.
7. 제6항에 있어서, 유기체는 식물로 정의되는, 세포 또는 유기체.
8. 서열번호 6으로 식별되는 아미노산 서열을 정의하는 단리된 히스피딘 수산화효소.
9. 히스피딘 수산화효소를 생성하는 방법으로서, 서열번호 5로 식별되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 정의하는 루시퍼라제를 암호화하는 단리된 핵산을 제공하는 단계로서, 아미노산 서열은 D37E, V181I, A183P, S323M, M385K로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단계; 및 단리된 핵산을 세포의 게놈 또는 염색체 외 요소(extrachromosomal element) 내로 통합(integrating)하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 단리된 핵산은 아미노산 치환 D37E, V181I, S323M 및 M385K를 포함하는 히스피딘 수산화효소를 암호화하는, 방법.
11. 서열번호 1로 식별되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 정의하는 단리된 히스피딘 수산화효소(hispidin hydroxylase)로서, 아미노산 서열은 T99P, T192S, A199P로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 루시퍼라제.
12. 제11항에 있어서, 아미노산 서열은 아미노산 치환 T99P, T192S 및 A199P를 포함하는, 단리된 루시퍼라제.
13. 제11항에 있어서, 아미노산 서열은 R2S, I3N, I3S, N4T, F11L, E12D, I63T로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 루시퍼라제.
14. 제11항에 있어서, 아미노산 서열은 아미노산 치환 I3S, N4T, F11L, I63T, T99P, T192S 및 A199P를 포함하는, 단리된 루시퍼라제.
15. 서열번호 3으로 식별되는 아미노산 서열을 정의하는 단리된 루시퍼라제.
16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단리된 루시퍼라제를 암호화하는, 핵산.
17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단리된 루시퍼라제를 포함하는 세포 또는 유기체.
18. 제17항에 있어서, 유기체는 식물로 정의되는, 세포 또는 유기체.
19. 서열번호 1로 식별되는 아미노산 서열의 40-267번 위치와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 정의하는 단리된 루시퍼라제로서, 아미노산 서열은 199번 위치에 프롤린을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 루시퍼라제.
20. 제19항의 단리된 루시퍼라제를 포함하는 세포 또는 유기체.

Description

변형 생물발광 효소 본 정규(non-provisional) 특허 출원은 미국 특허청에 2023년 8월 28일 자로 출원된 “Modified Bioluminescent Enzymes”라는 명칭의 계류 중인 미국 특허 가출원 제63/534,957호, 및 2024년 1월 9일 자로 출원된 “Modified Bioluminescent Enzymes”라는 명칭의 계류 중인 미국 특허 가출원 제63/619,077호에 따른 35 U.S.C. §119(e)의 모든 혜택을 주장하며, 이들 출원은 각각 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조 본 출원과 함께 제출된 전자 제출 서열 목록(Light_Bio_Inc_Sequence_Listing.xml, 파일 생성일 2024-08-23, 32 KB)의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 발명의 분야 본 개시는 일반적으로 생물학 및 화학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 생물발광 시스템에 관한 것이다. 선행기술의 설명 및 발명의 목적 생물발광(bioluminescence)은 생화학적 과정을 통해 빛을 방출하는 능력을 의미한다. 여러 유형의 생물발광이 알려져 있으며, 이들은 다양한 유기체에서 독립적으로 진화해 왔다. 생물발광을 생성하는 능력은 특정 단백질인 루시퍼라제(luciferase) 또는 광단백질(photoprotein)에 의해 제공된다. 루시퍼라제는 저분자 화합물인 루시페린(luciferin)의 산화를 촉매하여 빛을 방출하게 하는 효소이다. 반응의 생성물 분자인 옥시루시페린(oxyluciferin)은 이후 효소로부터 방출된다. 유기체 내의 생물발광은 루시페린의 이용 가능성에 의존하며, 이는 통상적으로 내인성 생합성(endogenous biosynthesis)을 통해 이루어진다. 루시페린의 구조는 생물발광의 유형에 따라 매우 다양하다. 대부분의 경우, 루시페린을 합성하는 데 필요한 단백질(및 해당 유전자)의 전체 세트는 알려져 있지 않다. 루시페린 생합성을 위한 경로는 두 가지만 발견되었다: 해양 박테리아의 지방산 대사 분지(lux 오페론에 의해 암호화됨) 및 진균류의 페닐프로파노이드 대사 분지(커피산(caffeic acid) 회로). 박테리아 경로는 1980년대 후반부터 알려져 왔으나, 낮은 광 출력과 경로 중간체의 독성으로 인해 진핵생물에는 널리 적용되지 않았다. 반면, 진균 네오노토파누스 남비(Neonothopanus nambi)(도 1)에서 빛 방출을 촉매하는 효소의 발견은 다른 다세포 유기체에 맞게 조정되었다. 특히, 이는 식물에서 자율 발광 및 리포터 도구(reporter tool)를 가능하게 하였다. 그럼에도 불구하고, 이 생물발광 경로의 유용성은 이종 숙주(heterologous host)에서의 불충분한 광자 수율로 인해 여전히 제한적이다. 이는 더 높은 기술적 요구사항을 요구함으로써 일부 응용 분야에서의 사용을 배제한다. 따라서 종래 기술과 관련된 문제 및 단점을 고려할 때, 식물, 진균 및 포유류 숙주에서 강화된 생물발광을 위해 해당 경로를 더욱 발전시킬 필요가 있다. 이러한 내용을 고려하여 본 개시가 고안되었으며, 본 개시의 목적 중 하나는 신규 생물발광 효소, 특히 신규 히스피딘 수산화효소(hispidin hydroxylase) 및 루시퍼라제, 및 이의 기능적 단편 및 이들을 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다. 본 개시는 또한 상기 신규 생물발광 효소를 포함하는 신규 조성물 및 사용 방법을 제공한다. 본 개시의 히스피딘 수산화효소는 히스피딘이 3-하이드록시히스피딘으로 전환되는 것을 촉매하는 반면, 루시퍼라제는 3-하이드록시히스피딘을 산화시켜 빛을 방출하게 한다. 본 개시의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하며, T99P, T192S, A199P로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 단리된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 것이다. 본 개시의 단리된 루시퍼라제의 하나 이상의 구현예는 서열번호 1의 40-267번 위치에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 개시의 또 다른 목적은 R2S, I3N, I3S, N4T, F11L, E12D, I63T로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 단리된 루시퍼라제를 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하며, 아미노산 치환 T99P, T192S 및 A199P를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단리된 루시퍼라제를 제공하는 것이다. 본 개시의 추가적인 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하며, 아미노산 치환 I3S, N4T, F11L, I63T, T99P, T192S 및 A199P를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단리된 루시퍼라제를 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 것이다. 일부 구현예에서, 루시퍼라제는 다른 아미노산 서열과의 융합체(즉, 융합 단백질)로서 존재한다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 서열번호 1에 대하여 2, 3, 4, 11, 12, 63, 99, 192, 199번으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 일부 구현예는 서열번호 1에 대하여 아미노산 R2, I3, N4, F11, E12, I63, T99, T192, A199 중 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 구현예는 서열 내의 다른 위치에 존재하는 아미노산의 치환을 추가로 포함한다. 본 개시의 또 다른 목적은 서열번호 1에 대하여 99, 192, 및 199번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 단리된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 일부 구현예는 서열번호 1에 대하여 아미노산 T99, T192, A199의 치환을 포함한다. 본 개시의 추가적인 목적은 서열번호 1에 대하여 99번 위치의 프롤린, 192번 위치의 세린, 또는 199번 위치의 프롤린 중 적어도 하나의 치환을 포함하는, 단리된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환이 서열 내의 다른 위치에 존재할 수 있다. 본 개시의 또 다른 목적은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 루시퍼라제를 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 목적은 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공하는 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하며, R2, I3, N4, F11, E12, I63, T99, T192, A199를 암호화하는 위치에서 적어도 하나의 코돈 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산은 아미노산 변화 R2S, I3N, I3S, N4T, F11L, E12D, I63T, T99P, T192S, 또는 A199P를 암호화하는 적어도 하나의 코돈 치환을 포함한다. 일부 구현예에서 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 3을 포함한다. 본 개시의 추가적인 목적은 숙주 세포에서의 핵산 발현에 필요한 조절 요소의 제어 하에 본 개시의 핵산을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 제공하는 것이며, 이는 세포 게놈에 통합되거나 염색체 외 요소의 형태로 세포에 도입되어, 핵산에 의해 암호화된 루시퍼라제의 발현을 제공할 수 있다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 본 개시의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공하는 것이다. 본 개시는 또한 본 개시의 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편, 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 숙주 세포로 전달하기 위한 하나 이상의 벡터(들)를 제공한다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 본 개시의 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편, 핵산, 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 세포, 안정적인 세포주, 형질전환 유기체(예를 들어, 식물, 동물, 진균, 박테리아, 미생물)를 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 목적은 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 생성하는 세포를 제공하는 것으로서, 상기 세포는 숙주 세포에서의 핵산 발현에 필요한 조절 요소의 제어 하에 핵산을 포함하는 발현 카세트를 더 포함하며, 이는 세포 게놈에 통합되거나 염색체 외 요소의 형태로 세포에 도입되어, 염색체 외 요소 또는 세포 게놈에 통합된 요소의 형태로 핵산에 의해 암호화된 루시퍼라제의 발현을 제공할 수 있다. 본 개시의 또 다른 목적은 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 생성하는 형질전환 유기체를 제공하는 것이다. 일부 구현예에서, 형질전환 유기체는 박테리아, 미생물, 식물, 진균 또는 동물이다. 본 개시의 또 다른 목적은 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편, 핵산, 또는 본 개시의 핵산을 포함하는 벡터 또는 발현 카세트를 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 본 개시의 추가적인 목적은 본 개시의 핵산 및 루시퍼라제를 사용하여 세포, 세포 구조 및 생체 분자를 표지하는 방법을 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 본 개시에 따른 루시퍼라제를 위한 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포, 세포 구조 및 생체 분자를 표지하는 방법을 제공하는 것이다. 본 개시의 또 다른 추가적인 목적은 형질전환 유기체에서 생물발광을 생성하는 방법을 제공하는 것이며, 형질전환 유기체는 본 명세서에 개시된 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 형질전환 유기체는 박테리아, 미생물, 식물, 진균 또는 동물이다. 본 개시의 또 다른 목적은 생물발광을 생성하기 위한 형질전환 유기체를 제공하는 것이며, 형질전환 유기체는 루시퍼라제 또는 이의 기능적 단편을 포함하고, 상기 형질