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KR-20260061288-A - METHODS FOR PURIFYING HETERODIMERIC, MULTISPECIFIC ANTIBODIES

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Abstract

용액으로부터 이종이량체 다중특이적 항체를 정제하는 방법이 제공된다.

Inventors

  • 조르겐센, 브렛
  • 쉘렌베르거, 유테

Assignees

  • 테네오바이오, 인코포레이티드

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20190920
Priority Date
20180921

Claims (20)

  1. 친화성 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 다중특이적 IgG 항체를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은: 단백질 A 크로마토그래피 수지를 포함하는 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼에 혼합물로부터의 다중특이적 IgG 항체를 고정시키는 단계; 및 항-응집성 조성물을 포함하는 용출 완충액에 의해 상기 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 용출하여, 상기 혼합물로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 정제하는 단계를 포함하되, 상기 항-응집성 조성물은 하나 이상의 폴리올을 포함하고, 상기 다중특이적 IgG 항체는 중쇄 단독 항체 또는 3-쇄 항체 유사 분자이고, 상기 용출 완충액은 3.2 내지 4.2 범위의 pH를 가지며, 상기 하나 이상의 폴리올은 만니톨, 글리세롤, 수크로스, 트레할로스 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것이고, 5% w/v 내지 25% w/v 범위의 농도를 갖는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리올은 5% w/v 내지 15% w/v 범위의 농도를 갖는 글리세롤을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 글리세롤은 10% w/v의 농도를 갖는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리올은 5% w/v 내지 15% w/v 범위의 농도를 갖는 수크로스를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 수크로스는 10% w/v의 농도를 갖는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 용출 완충액은 10% w/v 글리세롤 및 10% w/v 수크로스를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 용출 완충액은 시트레이트, 아세테이트, 아세트산, 4-모르폴린에탄설포네이트(MES), 시트레이트-포스페이트, 숙시네이트 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 용출 완충액은 시트레이트를 20mM 내지 30mM 범위의 농도로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 용출 완충액은 상기 시트레이트를 25mM의 농도로 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 용출 완충액은 3.4 내지 3.8 범위의 pH를 갖는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 용출 완충액은 3.6의 pH를 갖는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 용출 완충액은 25mM 시트레이트, 10% w/v 글리세롤, 및 10% w/v 수크로스를 포함하고, 상기 용출 완충액은 3.6의 pH를 갖는, 방법.
  13. 친화성 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 다중특이적 IgG 항체를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은: 상기 다중특이적 IgG 항체의 CH1 도메인에 대해 결합 친화성을 갖는 도메인-특이적 크로마토그래피 수지를 포함하는 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼에 혼합물로부터의 다중특이적 IgG 항체를 고정시키는 단계; 및 항-응집성 조성물을 포함하는 용출 완충액에 의해 상기 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 용출하여, 상기 혼합물로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 정제하는단계를 포함하되, 상기 항-응집성 조성물은 하나 이상의 폴리올을 포함하고, 상기 다중특이적 IgG 항체는 3-쇄 항체 유사 분자이고, 상기 용출 완충액은 3.4 내지 4.4 범위의 pH를 가지며, 상기 하나 이상의 폴리올은 만니톨, 글리세롤, 수크로스, 트레할로스 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것이고, 5% w/v 내지 25% w/v 범위의 농도를 갖는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리올은 5% w/v 내지 15% w/v 범위의 농도를 갖는 글리세롤을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 글리세롤은 10% w/v의 농도를 갖는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리올은 5% w/v 내지 15% w/v 범위의 농도를 갖는 수크로스를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 수크로스는 10% w/v의 농도를 갖는, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 용출 완충액은 10% w/v 글리세롤 및 10% w/v 수크로스를 포함하는, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 용출 완충액은 시트레이트, 아세테이트, 아세트산, 4-모르폴린에탄설포네이트(MES), 시트레이트-포스페이트, 숙시네이트 및 이들의 조합으로부터 선택되는 완충액을 포함하는, 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 용출 완충액은 아세트산을 45mM 내지 55mM 범위의 농도로 포함하는, 방법.

Description

이종이량체 다중특이적 항체의 정제 방법 {METHODS FOR PURIFYING HETERODIMERIC, MULTISPECIFIC ANTIBODIES} 관련 출원들에 대한 상호-참조 본 출원은 2018년 9월 21일자 제출된 미국 임시 특허출원 제62/734,566호, 뿐만 아니라 2018년 10월 8일자 제출된 미국 임시 특허출원 제62/742,821호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌들의 기재 내용은 본원에 전체가 인용되어 포함된다. 서열 목록 본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 전체적으로 참조로 통합된다. 2019년 11월 25일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 TNO-0015-WO_SL.txt이며 크기는 11,804 바이트이다. 본 발명의 기술 분야 본 발명은 용액으로부터 이종이량체 다중특이적 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 이중특이적 항체(BsAb)는 새로운 부류의 중요한 단백질 치료제이다. BsAb는 종종 면역 효과기 세포를 재표적화하여 암세포를 죽이려는 목적으로, 2개의 상이한 항원들을 인식하고 이에 결합하도록 고안된다. 최근에, 2개의 BsAb는 유럽 의학청(EMA: European Medicines Agency)에 의해, 그리고 하나는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 치료제로 승인받았다. 종종 이종이량체 다중특이적 항체의 정제 동안, 포획을 위해 종래의 단백질 A 크로마토그래피를 사용하면, 부분적으로, 미정제 BsAb 혼합물 중의 Fc-함유 생성물 변이체의 존재 때문에 문제가 있었다. 추가로, 다량체 단백질, 예컨대 항체는 응집되는 경향이 강하여, 불순물 수준이 유의하게 증가되는데 기여하였다. 이런 이유로, 생성물-특이적 (응집물 또는 분해 생성물) 및 공정 관련 불순물(배지 성분, HCP, DNA, 정제에 사용된 크로마토그래피 매체, 내독소, 바이러스 등)을 효과적으로 제거하고, 정확하고 완전한 충분한 양의 다중특이적 항체를 얻는 정제 방법을 개발할 필요성이 있다. 항체의 정제를 위한 다양한 방법들이 당업계에 알려져 있으나, 예를 들어, 공정-유발 변형 또는 제조 조건의 결과로서 형성될 수 있는 응집물 및 복합체로부터 다중특이적 항체를 분리 및 정제할 수 있는 대안적인 크로마토그래피 공정에 대한 필요성이 여전히 만족되지 못한 채로 존재한다. 본 발명의 개요 본 발명의 양태는 친화성 크로마토그래피에 의해 혼합물로부터 다중특이적 IgG 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: IgG 항체의 중쇄 불변 도메인에 대해 결합 특이성을 갖는 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼에 혼합물로부터의 다중특이적 IgG 항체를 고정시키는 단계; 및 항-응집성 조성물을 포함하는 용출 완충액에 의해 상기 다중특이적 항체를 상기 제1 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하여, 상기 혼합물로부터 상기 다중특이적 항체를 정제하되, 상기 항-응집성 조성물은 하나 이상의 폴리올을 포함하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 폴리올은 만니톨, 글리세롤, 수크로스, 트레할로스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 폴리올은 약 5% 내지 약 25% w/v 범위의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 폴리올은 약 5% 내지 약 15% w/v 범위의 농도를 갖는 글리세롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 글리세롤은 약 10% w/v의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 폴리올은 약 5% 내지 약 15% w/v 범위의 농도를 갖는 수크로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수크로스는 약 10% w/v의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 10% 글리세롤 및 약 10% 수크로스 w/v를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 크로마토그래피 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 시트레이트, 아세테이트, 아세트산, 4-모르폴린에탄설포네이트(MES), 시트레이트-포스페이트, 숙시네이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 시트레이트를 약 20mM 내지 약 30mM 범위의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 시트레이트를 약 25mM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 3.2 내지 약 4.2 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 3.4 내지 약 3.8 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 3.6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 25mM 시트레이트, 약 10% 글리세롤 및 약 10% 수크로스를 포함하고, 상기 용출 완충액은 약 3.6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 IgG 항체의 CH1 도메인에 결합하는 도메인-특이적 크로마토그래피 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 시트레이트, 아세테이트, 아세트산, 4-모르폴린에탄설포네이트(MES), 시트레이트-포스페이트, 숙시네이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 아세트산을 약 45mM 내지 약 55mM 범위의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 아세트산을 약 50mM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 3.4 내지 약 4.4 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 3.8 내지 약 4.2 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 4.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 용출 완충액은 약 50mM 아세트산, 약 10% 글리세롤 및 약 10% 수크로스를 포함하고, 상기 용출 완충액은 약 4.0의 pH를 갖는다. 본 발명의 양태는 친화성 크로마토그래피 과정에 의해 용출 풀 내에서 다중특이적 IgG 항체의 응집을 감소시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은: 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 다중특이적 IgG 항체를 고정시키는 단계; 및 25mM 시트레이트, 10 w/v% 글리세롤 및 10 w/v% 수크로스를 포함하는 용출 완충액에 의해 상기 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 용출하되, 상기 용출 완충액은 3.6의 pH를 갖는 단계를 갖는다. 본 발명의 양태는 친화성 크로마토그래피 과정에 의해 용출 풀 내에서 다중특이적 IgG 항체의 응집을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: 다중특이적 IgG 항체의 CH1 도메인에 대해 결합 친화성을 갖는 도메인-특이적 크로마토그래피 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼에, 다중특이적 IgG 항체를 고정시키는 단계; 및 50mM 아세트산, 10% 글리세롤 및 10% 수크로스를 포함하는 용출 완충액에 의해 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 다중특이적 IgG 항체를 용출하되, 상기 용출 완충액은 4.0의 pH를 갖는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 IgG 항체는 제1 결합 단위와 제2 결합 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 결합 단위는 중쇄-단독 항체의 중쇄 가변 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 결합 단위는 항체의 중쇄 가변 부위 및 항체의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 결합 단위는 중쇄-단독 항체의 중쇄 가변 부위를 포함하고, 상기 제2 결합 단위는 항체의 중쇄 가변 부위 및 항체의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 결합 단위는 종양-관련 항원에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제2 결합 단위는 효과기 세포에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제2 결합 단위는 T 세포 상의 CD3 단백질에 대해 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 다중특이적 IgG 항체는 이중특이적 IgG 항체이다. 이들 및 추가적인 양태는, 실시예들을 포함하는 본 기재 내용의 나머지에서 추가로 설명될 것이다. 도 1은 본 발명의 일부 구현예에 의한 BsAb 분자를 나타낸다. 도 2는 BsAb의 비-제한적인 예시를 나타낸다. 이러한 도시된 구현예는 제1 VH 도메인과 제2 VH 도메인을 포함하는 CD3-결합 암(arm)과 TAA-결합 암을 포함한다. 도시된 구현예에서, 제1 VH 도메인과 제2 VH 도메인은 동일하고, 둘 다 TAA에 대해 결합 친화성을 갖는다. 도 3은 도 2에 도시된 BsAb의 활성 형태 및 불활성 형태를 나타낸다. 활성 형태는 이종이량체인데 반해(패널 A), 불활성 형태는 TAA 동종이량체, 절반-Ab, CD3 동종이량체, 과잉 경쇄(LC) 및 응집물을 포함한다. 도 4는 SEC 분석을 위한 시간 함수로서의 흡광도 단위(AU)의 그래프를 나타낸다. 상기 그래프는 BsAb 이종이량체가 단지 CD3-결합 암만을 함유하는 CD3 동종이량체와 크기가 유사하다는 것을 나타낸다(도 3, 패널 B에 도시됨). 도 5는 BsAb 이종이량체, CD3 동종이량체 및 TAA 동종이량체가 상이한 등전점(pI)을 갖는다는 것을 나타내는 IEF 겔 분석을 도시한다. 도 6은 pH 3.6에서의 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 특성을 나타낸다. 그 결과는 용출된 피크가 총 통합 면적의 96%라는 것을 나타낸다. 로딩, 평형화 및 용출 조건이 기재되어 있다. 도 7은 SEC 분석을 위한 시간 함수로서의 흡광도 단위(AU)의 그래프를 도시하는데, 이는 BsAb가 pH 3.6에서의 단백질 A 용출 이후 응집된다는 것을 입증한다. 완충액 및 유속 조건이 기재되어 있다. 도 8은 고분자량 분획이 BsAb 생성물에 해당한다는 것을 확인하는 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 도 9는 첨가제가 단백질 A 용출된 BsAb의 응집을 감소시킬 수 있다는 것을 입증하는 일련의 그래프들을 나타낸다. 조사된 첨가제는 만니톨, 글리세롤, 수크로스 및 트레할로스를 다양한 조합으로 포함하였다. 도 10에서, 패널 A는 CH1 도메인을 포함하는 활성 BsAb 분자를 나타내고, 패널 B는 불활성 TAA 동종이량체를 나타