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KR-20260061292-A - HSD17B13 Variants And Uses Thereof

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Abstract

HSD17B13 의 변종과 관련된 분리된 핵산 및 단백질을 포함하여, HSD17B13 변종과 관련된 조성물, 및 이런 핵산 및 단백질을 포함하는 세포가 제공된다. 또한 HSD17B13 의 변종과 관련된 방법이 제공된다. 이러한 방법은 재조합 HSD17B13 유전자 또는 HSD17B13 단백질을 암호화하는 핵산을 발현시키기 위하여 뉴클레아제 제제, 외인성 도너 서열, 전사 활성화제, 전사 억제자, 및 발현 벡터의 임의의 조합을 사용을 통해 세포를 변형시키는 방법을 포함한다. 또한 만성 간 질환을 가졌거나 발병의 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 치료 및 예방 방법이 제공된다.

Inventors

  • 아불-후슨 노라 에스.
  • 바라스 아리스
  • 쉴디너 알란
  • 가츠맨 옴리
  • 리 알렉산더
  • 쳉 시핑
  • 신 유롱
  • 페파니스 에반겔로스
  • 하트포드 수잔느
  • 그로마다 제스퍼
  • 듀이 프레데릭 이.

Assignees

  • 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20180119
Priority Date
20170123

Claims (20)

  1. 세포에서 HSD17B13 유전자를 변형시키는 방법에 사용하기 위한, Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물로서, 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 부분 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 부분을 포함하고, 방법은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하여 HSD17B13 유전자의 코딩 영역 내의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하고, Cas9 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단하여 HSD17B13 유전자에서 표적화된 유전자 변형을 생성하며, 방법은 HSD17B13 유전자 기능 상실을 초래하고, 세포는 간 세포인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (a) 가이드 RNA 표적 서열이 SEQ ID NO: 20 내지 239, 및 259 내지 268 중 어느 하나를 포함하거나; (b) 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 1423 내지 1652 중 어느 하나를 포함하는 DNA-표적화 분절을 포함하거나; (c) 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 500 내지 1419 중 어느 하나를 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 세포가 인간 세포이고, (a) 가이드 RNA 표적 서열이 SEQ ID NO: 20 내지 239 중 어느 하나를 포함하거나; (b) DNA-표적화 분절이 SEQ ID NO: 1423 내지 1642 중 어느 하나를 포함하거나; (c) 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 500 내지 719, 730 내지 949, 960 내지 1179, 및 1190 내지 1409 중 어느 하나를 포함하는, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 세포가 마우스 세포이고, (a) 가이드 RNA 표적 서열이 SEQ ID NO: 259 내지 268 중 어느 하나를 포함하거나; (b) DNA-표적화 분절이 SEQ ID NO: 1643 내지 1652 중 어느 하나를 포함하거나; (c) 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 720 내지 729, 950 내지 959, 1180 내지 1189, 및 1410 내지 1419 중 어느 하나를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 추가 가이드 RNA 또는 하나 이상의 추가 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가 가이드 RNA는 HSD17B13 유전자 내의 하나 이상의 추가 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하고, 방법이 하나 이상의 추가 가이드 RNA 또는 하나 이상의 추가 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 하나 이상의 추가 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 하나 이상의 복합체를 형성하여 하나 이상의 추가 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산이 DNA를 포함하는, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산이 RNA를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 가이드 RNA를 RNA의 형태로 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA가 지질 나노입자에 있는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA가 아데노-관련 바이러스 벡터에 있는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 crRNA 부분이 tracrRNA 부분에 연결되어 있는 단일-분자 가이드 RNA인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 1420, 256, 257, 또는 258에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, crRNA 부분 및 tracrRNA 부분이 별도의 RNA 분자인, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, crRNA 부분이 SEQ ID NO: 1421에 제시된 서열을 포함하거나, tracrRNA 부분이 SEQ ID NO: 1422에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 변형되거나 조절된 안정성을 제공하는 변형을 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내에 있는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 간 세포 또는 마우스 간 세포인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 인간 간 세포인, 조성물.

Description

HSD17B13 변종 및 이것의 용도{HSD17B13 Variants And Uses Thereof} 관련 출원에 대한 상호 참조 본 출원은 2017년 1월 23일에 출원된 미국 출원 번호 62/449,335, 2017년 3월 17 출원된 미국 출원 번호 62/472,972, 2017년 11 6에 출원된 미국 출원 번호 62/581,918의 이익을 주장하며, 상기 출원들은 각각 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. EFS 웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조 파일 507242SEQLIST.txt로 필기된 서열 목록은 507 킬로바이트이며, 2018년 1월 19일에 생성되었고, 본원에 참조로 포함된다. 기술분야 본 발명은 HSD17B13 변종 및 이것의 용도에 관한 것이다. 만성 간 질환 및 간경변은 미국에서 이병률 및 사망률의 선두 요인이며, 2014년에 38,170건 (총 사망건수의 1.5%)의 사망을 차지한다 (Kochanek et al. (2016) Natl Vital Stat Rep 65:1-122, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 미국에서 간경변의 가장 공통적인 병인은 알코올성 간 질환, 만성 C형 간염, 및 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)이며, 이것들은 함께 2004년과 2013년 사이에 간 이식을 기다리고 있는 환자들의 약 80%를 차지한다 (Wong et al. (2015) Gastroenterology 148:547-555, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 미국에서 NAFLD의 추정된 유병률은 19 내지 46 퍼센트이고 (Browning et al. (2004) Hepatology 40:1387-1395; Lazo et al. (2013) Am J Epidemiol 178:38-45; 및 Williams et al. (2011) Gastroenterology 140:124-131, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 시간이 지남에 따라 상승하고 있는데 (Younossi et al. (2011) Clin Gastroenterol Hepatol 9:524-530 e1; quiz e60 (2011), 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 그것의 주요 위험 인자인 비만의 증가 속도와 유사하다 (Cohen et al. (2011) Science 332:1519-1523, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). C형 간염의 치료에서 상당한 진보가 이루어진 한편 (Morgan et al. (2013) Ann Intern Med 158:329-337 및 van der Meer et al. (2012) JAMA 308:2584-2593, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 현재 알코올성 또는 비알코올성 간 질환 및 간경변에 대한 증거-기반 치료는 없다. 이전의 전 게놈 관련 연구 (genome wide association studies, GWAS)로 만성 간 질환과 관련된 제한된 수의 유전자 및 변종이 확인되었다. 오늘날까지 가장 강력하게 입증된 유전자 연관성 연구는 초기에 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 증가된 위험과 관련이 있는 것으로 발견되고 (Romeo et al. (2008) Nat. Genet. 40:1461-1465 및 Speliotes et al. (2011) PLoS Genet. 7:e1001324, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 계속해서 질환의 중증도 (Rotman et al. (2010) Hepatology 52:894-903 및 Sookoian et al. (2009) J. Lipid Res. 50:2111-2116, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 및 진행 (Trepo et al. (2016) J. Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2016.03.011, 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)과 관련이 있는 것으로 밝혀진, 3개의 유전자를 함유한 파타틴-유사 포스포리파아제 도메인의 공통 미스센스 변종에 대한 것이다. 경막 6 수퍼패밀리 구성원 2 (TM6SF2) 유전자의 변이는 또한 NAFLD에 대한 증가된 위험을 부여하는 것으로 나타났다 (Kozlitina et al. (2014) Nat. Genet. 46:352-356; Liu et al. (2014) Nat. Commun. 5:4309; 및 Sookoian et al. (2015) Hepatology 61:515-525, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 이 두 단백질의 정상 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 둘 다 간세포 지질 대사에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. PNPLA3 및 TM6SF2에서의 변종이 어떻게 간 질환의 증가된 위험에 기여하는지는 아직 설명되지 않았다. GWAS는 또한 임상적으로 빈번하게 측정되는 간세포 손상 및 간 지방 축적의 정량적 마커인 혈청 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 및 아스파테이트 아미노전이효소 (AST) (Chambers et al. (2011) Nat. Genet. 43:131-1138 및 Yuan et al. (2008) Am. J. Hum. Genet. 83:520-528, 이 문헌들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)와 관련이 있는 몇몇 유전적 인자를 확인하였다. 오늘날까지, 만성 간 질환에 대한 보호성 유전자 변종은 기술된 것이 없다. 다른 환경에서의 보호성 유전자 변종의 발견, 예컨대 심혈관 질환의 위험을 감소시키는 PCSK9에서의 기능-상실 변종의 발견은 새로운 부류의 치료제의 개발에 대한 촉매가 되었다. 도 1A 및 1B는 GHS 개발 집단에서 중앙값의 알라닌 아미노전이효소 (ALT; 도 1A) 및 아스파테이트 아미노전이효소 (AST; 도 1B) 수준과 관련하여 단일 뉴클레오타이드 변종의 맨하탄 도표 (좌측) 및 분위수 대 분위수 도표 (우측)를 도시한다. 도 1A는 16개 유전자 중 P < 1.0 x 10-7에서 ALT 수준 (N=41,414)과 유의하게 관련된 31개의 변종이 있었음을 보여준다. 도 1B는 10개 유전자 중 P < 1.0 x 10-7에서 AST 수준 (N=40,753)과 유의하게 관련된 12개의 변종이 있었음을 보여준다. 모든 유의한 관련은 표 2에 나타낸다. 3개의 별도의 유럽-혈통 집단의 반복 메타-분석에서 ALT 또는 AST와 유의하게 관련된 채로 유지된, HSD17B13을 포함한, 9개의 유전자 (유전자 명칭에 의해 표시됨) 중 13개의 변종이 있었다 (표 3). 연관성 테스트는 엑솜-전체 분위수 대 분위수 도표 및 게놈 대조군 람다 값에 의해 나타난 바와 같이, 잘 보정되었다 (도 1A 및 도 1B). 도 2A 및 2B는 HSD17B13 rs72613567:TA가 개발 집단에서 알코올성 및 비알코올성 간 질환 표현형의 위험의 감소와 관련되며 (도 2A), 베리아트릭 수술 집단에서 단순 지방증으로부터 지방간염 및 섬유증으로의 진행의 위험의 감소과 관련된 (도 2B) 것을 보여준다. 오즈비(odds ratio)는 로지스틱 회귀를 사용하여 계산되었고, 이때 연령, 연령2, 성별, BMI, 및 혈통의 주요 구성요소들에 대해 조정되었다. 이형접합성 (Het OR) 및 동형접합성 (Hom OR) 보균자에 대한 유전자형 오즈비가 또한 도시된다. 도 2A의 GHS 개발 집단에서, 변종 HSD17B13은 대립유전자 용량-의존 방식으로 비알코올성 및 알코올성 간 질환, 간경변, 및 간세포 암종의 유의하게 감소된 위험과 관련되었다. 도 2B의 GHS 베리아트릭 수술 집단에서, HSD17B13 rs72613567은 이형접합성 및 동형접합성 TA 보균자에서, 각각, 비알코올성 지방간염 (NASH)의 13% 및 52% 더 낮은 오즈 및 섬유증의 13% 및 61% 더 낮은 오즈와 관련이 있었다. 도 3A 내지 3D는 HSD17B13 rs72613567 스플라이스 변종의 동형접합성 기준 (T/T), 이형접합성 (T/TA), 및 동형접합성 대체물 (TA/TA) 보균자에서 4개의 HSD17B13 전사물 (A 내지 D)의 발현을 도시한다. 각 전사물은 상응하는 유전자 모델로 예시된다. 유전자 모델에서 코딩 영역들은 줄무늬 박스로 표시되고 미번역 영역은 검은색 박스로 표시된다. 도 3A는 전사물 A의 대표도 및 전사물 A에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 도 3B는 전사물 B의 대표도 및 전사물 B에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 전사물 B에서, 엑손 2는 빠져 있다. 도 3C는 전사물 C의 대표도 및 전사물 C에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 전사물 C에서, 엑손 6은 빠져 있다. 도 3D는 전사물 D의 대표도 및 전사물 D에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 전사물 D에서 별표는 단백질의 미성숙 절단으로 이어지는, 엑손 6의 3' 단부에서의 rs72613567로부터의 G의 삽입을 나타낸다. 전사물 D는 HSD17B13 스플라이스 변종의 동형접합성 보균자에서 우세한 전사물이 된다. 유전자 발현은 FPKM 단위 (백만개의 지도화된 판독 당 전사물의 킬로염기당 단편)로 표현된다. 도 3B 및 도 3C의 삽도는 확대된 관점을 보여준다. 도 4는 인간 간의 RNA-Seq 연구가 6개의 신규한 HSD17B13 전사물 (전사물 C 내지 H)을 포함한, 8개의 HSD17B13 전사물을 드러냈음을 도시한다. 전사물의 발현은 FPKM 단위 (백만개의 지도화된 판독 당 전사물의 킬로염기당 단편)로 표현된다. 전사물의 구조는 도면의 우측에 제공된다. 도 5A 및 5B는 ALT 및 AST에 대한 GHS 개발 집단에서, 각각, HSD17B13의 유전자좌-줌 도표 (HSD17B13 주변 영역의 위치적 연관성 도표)를 도시한다. 영역 전체에서 유의미한 재조합은 관찰되지 않았다. 다이아몬드형은 스플라이스 변종 rs72613567을 나타낸다. 각각의 원형은 단일 뉴클레오타이드 변종을 나타내고 원형의 색은 변종과 rs72613567 사이의 연쇄 불균형 (DiscovEHR 집단에서 계산된 r2)을 나타낸다. 선은 HapMap에서 추정된 재조합 속도를 나타낸