KR-20260061413-A - RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING L-AMINO ACID, AND CONSTRUCTION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158을 출발균으로 사용하여, 그 NCgl1089 유전자 암호화 영역, 및/또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역, 및/또는 ptsS 유전자 암호화 영역에 부위 특이적 돌연변이 및/또는 개선된 발현을 도입하며, 획득된 돌연변이 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 균주는 고효율의 L-아미노산 생산 능력을 가지며, 이는 L-아미노산의 생산량을 크게 증가시키고, 균주 안정성이 우수하여, L-아미노산 생산 균주로서 생산비용을 절감시킨다.

Inventors

• 멍 강
• 구어 시아오웨이
• 자오 춘광
• 웨이 아이잉
• 저우 시아오췬
• 마 펑용
• 양 리펑
• 수 허우보
• 지아 후이핑
• 티엔 빈

Assignees

• 닝샤 에펜 바이오테크 코 엘티디

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20210104

Priority Date

20200807

Claims (8)

1. L-라이신 또는 L-글루탐산을 생성하는 미생물에 있어서, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있어 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 170번째 글루탐산이 라이신에 의해 치환되며; 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum )인 것을 특징으로 하는, L-라이신 또는 L-글루탐산을 생성하는 미생물.
2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물.
3. 제1항에 있어서, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물.
4. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서, SEQ ID NO:4를 포함하여 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
5. 아미노산 서열에 있어서, 상기 서열이 SEQ ID NO:4로 표시되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열.
6. 재조합 벡터에 있어서, 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
7. 재조합 균주에 있어서, 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 균주.
8. L-라이신 또는 L-글루탐산 생산 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항에 따른 미생물 또는 제7항에 따른 재조합 균주를 배양하고 상기 배양물로부터 L-글루탐산 또는 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, L-라이신 또는 L-글루탐산 생산 방법.

Description

L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축방법과 응용 {RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING L-AMINO ACID, AND CONSTRUCTION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF} 본 출원은 2020년 08월 07일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020107908681인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하고, 2020년 10월 15일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020111050353인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하고, 2020년 10월 13일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020110930801인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하며, 상술한 선행 출원의 전문은 인용 방식에 의해 본 출원에 결합되었다. 본 발명은 유전공학 및 미생물 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 강화된 L-아미노산 생산 능력을 갖는 코리네박테리움속의 균주, 이의 구축 방법과 응용에 관한 것이다. L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아 등 미생물을 사용하여 발효함으로써, 산업적으로 L-아미노산을 생산한다. 이러한 미생물로서는, 예를 들어 자연계로부터 분리된 균주 및 이의 돌연변이체 균주를 사용할 수 있다. 발효법에 의한 L-아미노산 생산에 대한 개선은 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술에 관한 것이거나; 발효 과정 중의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성에 관한 것이거나; 발효액을 건조 및 조립하거나 이온 교환 크로마토그래피를 통하는 것과 같이 발효액을 적합한 제품 형태로 가공하는 것에 관한 것이거나; 관련 미생물 자체의 고유한 성능 성질에 관한 것일 수 있다. 이러한 미생물의 성능 성질을 개선하기 위한 방법에는 돌연변이 유발, 돌연변이 선별 및 스크리닝이 포함된다. 이러한 방식으로 획득한 균주는 항대사물질에 내성이 있거나 조절 중요성을 갖는 대사물질에 대해 영양요구성이며 L-아미노산을 생성한다. 현재 고수율로 보다 경제적으로 L-아미노산을 생산하는 방법을 개발할 필요성이 여전히 존재한다. 이하에서는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통해 본 발명의 상기 내용 및 기타 특성과 장점을 보다 상세하게 해석하고 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명의 기술적 방안을 예시적으로 설명하기 위한 목적으로 사용되며, 이는 청구범위 및 그 등가의 방안에 의해 한정되는 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것이 아님에 유의한다. 달리 명시되지 않는 한, 이하의 실시예에 사용된 원료 및 시약은 모두 시판되는 제품이거나 공지된 방법으로 제조할 수 있는 것이다. 수행되는 조작은 모두 당업계에 공지된 것이거나 시판되는 제품의 사용자 지침에 따른 것이다. 하기 실시예에서 상기 균주 배양에 사용된 기본 배지는 조성이 동일하며, 이 기본 배지 조성에 상응하는 필요한 수크로스, 카나마이신 또는 클로람페니콜 등을 첨가한다. 기본 배지 조성은 하기와 같다. 하기 실시예에서 상기 SSCP 전기영동 PAGE의 제조 및 조건은 하기와 같다. 실시예 1 (1) 점 돌연변이의 NCgl1089 유전자 암호화 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-NCgl1089G508A 구축 NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl1089 유전자 암호화 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립 유전자 치환의 방식으로 균주 YP97158(기탁 번호: CGMCC No.12856, 기탁 날짜: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기재됨) 배경 중의 NCgl1089 유전자 암호화 영역(SEQ ID NO:1)에 점 돌연변이를 도입하고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3이고, NCgl1089 유전자의 뉴클레오티드 서열 508번째 G가 A(SEQ ID NO:2: NCgl1089G508A)로 변이되고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열 170번째 글루탐산이 라이신(SEQ ID NO:4:NCgl1089E170K)으로 변이되었다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성). P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGCGTGGGATCCACGCCAG 3'(SEQ ID NO:5) P2: 5'CAATGAGGGCTTTCGCCACCTCGCGGGC 3'(SEQ ID NO:6) P3: 5'GCCCGCGAGGTGGCGAAAGCCCTCATTG 3'(SEQ ID NO:7) P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATGCGTTGGCGATCTTC 3'(SEQ ID NO:8) 구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하며, 각각 프라이머 P1과 P2, P3과 P4로 PCR 증폭을 수행한다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신하여, 각각 724bp와 839bp인 두 가지 크기의, NCgl1089 유전자 암호화 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl1089Up 및 NCgl1089Down)을 획득하였다. 상기 두 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 상기 두 DNA 단편을 템플릿으로 하고, P1과 P4를 프라이머로 사용하여, 중첩 PCR을 통해 약 1535 bp 길이의 단편을 증폭하였다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신. 이 DNA 단편(NCgl1089G508A)은 YP97158 NCgl1089 유전자 암호화 영역의 508번째의 구아닌(G)을 아데닌(A)으로 변이시키고, 최종적으로 암호화 단백질의 170번째 아미노산을 글루탐산(E)에서 라이신(K)으로 변이시킨다. pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입)를 Xba I로 효소 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동으로 선형화 pK18mobsacB 플라스미드와 NCgl1089G508A를 분리 정제한 다음, NEBuider 재조합 시스템을 통해 조립하여, 벡터 pK18-NCgl1089G508A를 획득하며, 상기 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 벡터 pK18-NCgl1089G508A를 시퀀싱 동정을 위해 시퀀싱 회사로 송부하였으며, 정확한 점 돌연변이(G-A)를 포함하는 벡터 pK18-NCgl1089G508A는 향후 사용을 위해 보존하였다. (2) 점 돌연변이의 NCgl1089G508A를 포함하는 공학 균주 구축 구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-NCgl1089G508A를 전기천공으로 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 형질전환하고(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형의 NCgl1089 유전자 암호화 영역이 남아있는지 확인), 배양 생성된 단일 콜로니는 프라이머 P1과 유니버셜 프라이머 M13R로 각각 동정하며, 1542bp 크기의 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양하며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 성장하고, 카나마이신이 포함된 배지 상에서 성장하지 않은 균주는 하기와 같은 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 더 수행한다. P5: 5'GGTGATTGATGCATTATGCGC 3'(SEQ ID NO:9) P6: 5'CCTAGCCTTTCACCTCTTCTGT 3'(SEQ ID NO:10) 상기 PCR 증폭 산물은 고온 변성, 빙욕 후 sscp 전기영동을 수행하였고(플라스미드 pK18-NCgl1089G508A 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용), 단편 구조가 상이하고 전기영동 위치가 상이하기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않으며 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 프라이머 P5와 P6을 이용하여 대립 유전자 치환이 성공한 균주 표적 단편을 다시 PCR 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱하며, 서열 비교를 통해 염기 서열에 돌연변이가 발생한 서열이 균주의 대립유전자 치환 성공을 검증하고, YPL-4-017로 명명하였다. (3) 게놈 상에 NCgl1089 또는 NCgl1089G508A 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축 NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 의거하여, 4쌍의 업다운스트림 상동성 아암 단편 및 NCgl1089 유전자 암호화 영역, NCgl1089G508A 유전자 암호화 영역, 및 상기 유전자 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl1089 또는 NCgl1089G508A 유전자를 도입하였다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성). P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:11)