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KR-20260061438-A - HUMAN NEUREGULIN-1 (NRG-1) RECOMBINANT FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF

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Abstract

본 발명은 단클론성 항체(mAb) 골격에 융합된 심장보호 단백질 뉴레귤린-1(NRG-1)의 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질 및 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 및 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 치료적 유효량의 재조합 융합 단백질 또는 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

Inventors

  • 리 존
  • 리 셩웨이
  • 루오 디샹
  • 우 이란
  • 저우 밍
  • 장 샤오레이
  • 화 량
  • 루오 펑이
  • 왕 양

Assignees

  • 샐러브리스 바이오테라퓨틱스, 인크.
  • 살루브리스 (청두) 바이오테크 코., 리미티드

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20190411
Priority Date
20180411

Claims (20)

  1. 재조합 융합 단백질(recombinant fusion protein)로서, 단클론성 항체(mAb) 골격(backbone)에 융합된 심장보호 단백질인 뉴레귤린-1(neuregulin-1: NRG-1)의 단편을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 활성 단편을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 NRG-1의 활성 단백질 단편은 상기 NRG-1의 활성 도메인을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mAb는 ErbB3(HER3)에 대해서 단일특이적인, 재조합 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 ERBB3/4 결합 도메인을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 ErbB4(HER4)에 결합되어 ErbB4(HER4)를 통해서 신호전달을 유도하는, 재조합 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 mAb는 ErbB3(HER3)을 통해서 NRG-1 신호전달을 저해하는, 재조합 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 NRG-1 β2a 아이소폼(isoform)을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 링커를 이용해서 상기 단편의 N-말단 아미노산을 통해서 상기 항체의 중쇄의 C-말단에 융합되는, 재조합 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 5에 제시된 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 링커의 적어도 하나의 카피(copy)를 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 상기 C-말단은 상기 항체의 Fc 도메인을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 글리코실화된, 재조합 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 글리코실화는 N-글리코실화인, 재조합 융합 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 상기 글리코실화는 O-글리코실화인, 재조합 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NRG-1 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mAb는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄를 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mAb는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 상기 성숙 mAb는 서열번호 2의 아미노산 234, 239 및 434 중 적어도 하나에 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 L234F 돌연변이, S239A 돌연변이, N434A 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함하는, 재조합 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 3 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 융합 단백질.

Description

인간 뉴레귤린-1(NRG-1) 재조합 융합 단백질 조성물 및 이의 사용 방법{HUMAN NEUREGULIN-1 (NRG-1) RECOMBINANT FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF} 관련 출원에 대한 상호 참조 본 출원은 2018년 4월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/656,246호에 대한 우선권 및 이의 유익을 주장하고, 이의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 서열번호의 참조에 의한 포함 본 출원은 EFS-Web을 통해서 ASCII 포맷으로 제출되고 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 서열 목록을 포함한다. 2019년 3월 16일자로 작성된 상기 ASCII 사본은, SBTI-001-001WO_SeqList.txt로 지칭되고 그 크기는 31,328 바이트이다. 교세포 성장 인자(glial growth factor: GGF) 및 새로운 분화 인자(new differentiation factor: NDF)라고도 알려진 뉴레귤린(NRG; 헤레귤린(heregulin), HRG)은 44 KD의 분자량을 가진 일종의 당단백질이다. NRG 단백질 패밀리는 4가지 구성원, 즉, NRG-1, NRG-2, NRG-3 및 NRG-4를 갖는다. NRG(NRG-1 포함)는 심장의 발달에 특히 중요한 역할을 한다. ErbB 패밀리의 타이로신키나제 수용체의 리간드로서, NRG-1은 막-결합 ErbB3 또는 ErbB4에 직접 결합하여, 이량체화(dimerization)를 유도해서 ErbB2/ErbB4, ErbB2/ErbB3, ErbB3/ErbB3 및 ErbB4/ErbB4 복합체, 및 후속의 세포내 신호전달을 일으킨다. 동물 모델에서, NRG의 발현은 파라크린 신호전달(paracrine signaling)을 유도하여, 배아발생 동안 심장 조직에서 성장과 분화를 촉진시켜서, ErbB2, ErbB4 또는 NRG-1 중 어느 하나를 결실시켜 배아 치사를 초래한다. 또한, ErbB2 수용체 신호전달을 차단하는 암 요법은 유의한 심장독성 부작용을 나타내왔고, 인간에서 ErbB2-매개 신호전달이 건강한 심장 조직의 발달에뿐만 아니라 항상성에도 중요한 것이 입증되고 있다. 증거는 또한 NRG-1 신호 형질도입(signal transduction)이 인간 질환(조현병 및 두경부암 포함)의 발병에서뿐만 아니라 기타 기관계의 발달과 기능에서 부분적으로 역할하는 것을 나타낸다. NRG-1은 많은 이성질체를 갖는다. 유전자 돌연변이된 마우스(유전자 넉아웃 마우스(gene knock-out mice))에서의 연구는 상이한 N 말단 영역 또는 EGF-유사 도메인을 갖는 이성질체가 상이한 생체내 기능을 갖는 것을 나타낸다. 본 발명은 NRG-1βa2 아이소폼(isoform)에 기초한다. 내인성 NRG-1은 ErbB3(HER3)과 ErbB4(HER4) 둘 다에 결합하고 이들 둘 다를 통한 신호을 유도한다. 많은 전임상 및 임상 연구는, 주로 심근세포-발현 ErbB4(HER4)와의 상호작용을 통해서 각종 심혈관 징후에 대한 NRG-1의 치료적 잠재성을 나타내었다. 그러나, 3가지 주된 인자는 재조합 인간 NRG-1(rhNRG-1)의 임상 응용 및 유용성을 제한한다. 첫 번째로, HER3을 통한 NRG-1의 신호전달은, 암 발생 및/또는 진행을 촉진시킬 수 있어, 심각한 심혈관(cardiovascular: CV) 위험 인자 없이 또는 만성 투여를 필요로 하는 임의의 적용에 대하여 상당한 우려가 제기될 수 있다. 두 번째로, NRG-1에 의한 HER3의 과활성화는 위장(gastrointestinal: GI) 상피 온전성을 파괴시켜서, 심각한 GI 독성을 초래하고, 따라서 NRG-1에 대한 치료창의 손실을 초래할 수 있다. 세 번째로, rhNRG-1의 두 임상-단계 활성 단백질 단편은 짧은 반감기를 나타내는데, 이는 부담스러운 투약 및 투여 스케줄이 목적하는 치료 수준의 노출을 달성하기 위하여 요구될 수 있는 것을 나타낸다. 그러므로, 암 진행의 더 낮은 종양형성 또는 촉진 위험, 더 양호한 GI 내약성 및 더 바람직한 약동학적(PK) 프로파일을 갖지만, 각종 심혈관 징후에 대한 임상적으로 유의한 치료적 잠재성을 유지하는 NRG-1-기반 치료제를 제공할 필요성이 존재한다. 본 발명은 rhNRG-1 활성 도메인의 HER3-특이적 길항제 항체와의 융합을 포함하는 재조합 단백질을 제공함으로써 이러한 필요성을 해소한다: HER3 신호전달은 rhNRG-1의 종양형성 위험 및 GI 독성을 완화시키는 방식으로 차단되고, 동시에 항체 골격(backbone) 포맷은 전형적인 단클론성 항체의 분자 반감기를 부여하여, 제품에 대한 더욱 편리한 투약 및 투여를 가능하게 한다. 일 양상에 있어서, 본 발명은, 단클론성 항체(mAb) 골격에 융합된 심장보호 단백질인 뉴레귤린-1(neuregulin-1: NRG-1)의 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질(recombinant fusion protein)에 관한 것이다. 관련된 양상에 있어서, NRG-1 단편은 링커를 통해서 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다. 다른 관련된 양상에 있어서, NRG-1은, NRG-1의 N-말단 상의 일 실시형태에서 세린(S 또는 Ser) 아미노산인 첫 번째(제1) 아미노산을 통해서 링커에 부착된다. 관련된 양상에 있어서, 단편은 NRG-1의 활성 도메인을 포함하는 활성 단편이다. 다른 관련된 양상에 있어서, mAb는 ERBB3(HER3)에 대해서 단일특이적이다. 다른 관련된 양상에 있어서, NRG-1은 NRG-1 β2a 아이소폼이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 항-HER3 단클론성 항체 골격에 융합된 심장보호 단백질 뉴레귤린-1(NRG-1)의 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 치료적 유효량의 재조합 융합 단백질 또는 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 대상체에서 심혈관 질환 또는 병태의 발병(onset)을 예방, 저해, 억제 또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 유효량의 재조합 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 CNS-관련 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 치료적 유효량의 재조합 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 대상체에서 CNS-관련 질환 또는 병태의 발병을 예방, 저해, 억제 또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유효량의 재조합 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, NRG-1은 ErbB4(HER4)에 결합하고 이를 통한 신호전달을 유발한다. 다른 관련된 양상에 있어서, mAb는 ERBB3(HER3)을 통한 NRG-1 신호전달을 저해한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 재조합 융합 단백질 또는 본 발명의 재조합 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 다른 특성 및 이점은 이하의 상세한 설명 예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 실시형태를 나타내는 구체적인 예는, 본 발명의 정신과 범위 내의 각종 변화와 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이므로 단지 예로써 부여되는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 각종 목적과 이점 그리고 더욱 완전한 이해는 첨부 도면과 관련하여 취할 때 이하의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위를 참조함으로써 명백해지고 더욱 용이하게 이해된다: 도 1은 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 플라스미드의 구성을 도시한다. 도 2A 내지 도 2D는 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질의 개략적 구조를 예시한다. 도 2A는 본 개시내용의 항-HER3 mAb/NRG-1 융합 단백질의 분자 개략도를 예시한다. 도 2B는 SDS-PAGE 분석에 의해 생성된 대표적인 데이터를 도시한다. 도 2C는 HER3/4 결합 도메인을 포함하는 NRG-1("NRG-1", R&D Systems, 미네소타 미니애폴리스 소재)의 61-아미노산 활성 단편에 특이적인 1차 항체에 의해 검출된 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 도시한다. 도 2D는 IgG에 특이적인 1차 항체에 의해 검출된 웨스턴 블롯 결과를 도시한다. 도 3은, 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질이 HER3 단백질에 결합하고(곡선 1, 단계 2) 항-NRG-1 항체에 동시에 결합할 수 있는(곡선 1, 단계 3) 것을 도시한 결합 분석을 예시한다. 단, Fc 돌연변이는 본 명세서에 개시된 재조합 융합 단백질에 도입되어 HER3 특이적 항체를 암호화하는 모 항체(parent antibody) 서열의 Fc 효과기 기능을 넉아웃시켜서, HER3 수용체를 발현하는 정상 조직을 향하여 원치 않는 세포독성을 완화시킬 수 있다. 도 4A 내지 도 4D는 항-HER3 mAb/NRG-1 융합 단백질 또는 대조군으로 처리된 상이한 암세포주에 대해서 평균 상대 성장률 ± SEM(n = 3)을 도시한 대표적인 그래프를 도시한다. 도 4A는 NCI-N87 위 암세포주에서의 평균 상대 성장률을 도시한다. 도 4B는 MCF-7 유방 암세포주에서의 평균 상대 성장률을 도시한다. 도 4C는 RT-112 방광 암세포주에서의 평균 상대 성장률을 도시한다. 도 4D는 T47D 유방 암세포주에서의 평균 상대 성장률을 도시한다. 대조 NRG-1 펩타이드 및 GP120 mAb/NRG-1 융합 단백질과 비교해서, 본 명세서에서 제공되는 재조합 융합 단백질은 암세포 증식을 촉진시킴에 있어서 현저하게 낮은 활성도를 입증한다. 도 5A 내지 도 5B는, 저감된 암세포 성장 잠재성에도 불구하고, 본 명세서에서 제공되는 재조합 융합 단백질이 심근세포에서 PI3K/AKT 신호전달을 유도하는 능력을 완전히 보존하는 것을 예시