Search

KR-20260061466-A - Mage A4 T cell Receptors

KR20260061466AKR 20260061466 AKR20260061466 AKR 20260061466AKR-20260061466-A

Abstract

본 발명은 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(TCR) 및 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, TCR을 발현하는 세포 및 TCR을 포함하는 약학 조성물이 추가로 포함된다. 본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한 TCR, 특히 암 치료에 사용하기 위한 TCR에 관한 것이다.

Inventors

  • 엘링거, 크리스티안
  • 좀머마이어, 다니엘
  • 블랙번 파슨스, 게오프라이
  • 만, 야스데프

Assignees

  • 메디진 이뮤노테라피스 게엠바하
  • 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20200327
Priority Date
20190327

Claims (20)

  1. MAGE-A4에 특이적인 재조합 T 세포 수용체(TCR)로서, 상기 TCR은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR α 영역을 포함하는 TCR α 사슬, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 TCR β 영역을 포함하는 TCR β 사슬 을 포함하는, 재조합 TCR.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TCR은 a) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편; b) 서열 번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A2 결합 형태; 및/또는 c) HLA-A*02:01 암호화된 분자로 제시되는 서열 번호 1의 아미노산 서열 을 특이적으로 인식하는, 재조합 TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬은 각각 최소한으로 뮤린화된 Cα 영역 및 Cβ 영역을 포함하는, 재조합 TCR.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가변 TCR α 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 가변 TCR β 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TCR.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TCR α 사슬은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 TCR β 사슬은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TCR.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TCR α 사슬은 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 TCR β 사슬은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TCR.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TCR α 사슬은 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 TCR β 사슬은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TCR.
  8. 제1항 또는 제2항에 따른 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체.
  9. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 110에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  10. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 TCR 또는 제9항 또는 제10항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 TCR은 서열 번호 105에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 106에 의해 암호화되는 TCR β 사슬을 포함하는, 핵산.
  13. 제11항에 있어서, 상기 TCR은 서열 번호 77에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 78에 의해 암호화되는 TCR β 사슬을 포함하는, 핵산.
  14. 제11항에 있어서, 상기 TCR은 서열 번호 46에 의해 암호화되는 TCR α 사슬 및 서열 번호 47에 의해 암호화되는 TCR β 사슬을 포함하는, 핵산.
  15. 제11항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 95에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
  16. 제11항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 107에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
  17. 제11항의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제1항 또는 제2항에 따른 TCR을 발현하는 단리된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포는 면역 이펙터 세포인, 단리된 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 또는 자연 살해 T(NKT) 세포인, 단리된 세포.

Description

MAGE A4 T 세포 수용체{Mage A4 T cell Receptors} 관련 출원에 대한 상호 참조 본 출원은 2019년 3월 27일자로 출원된 유럽특허출원 제19 165 387호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 인용된다. 서열 목록에 관한 진술 본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 참조로서 본 명세서에 통합된다. 서열 목록이 포함된 텍스트 파일의 명칭은 MED16702PCT_ST25이다. 2020년 3월 24일에 생성된 텍스트 파일은 146 KB이었으며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다. 기술분야 본 발명은 MAGE-A4에 특이적인 단리된 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR), TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, TCR을 암호화하는 핵산, TCR을 발현하는 세포, 및 이를 포함하는 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의학적 치료 방법에서 또는 제형화를 위해 상기를 이용하는 방법 및/또는 약제로 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다. 세포 매개 면역 시스템의 일부를 형성하는 T 림프구(또는 T 세포)는 병원체의 박멸에 중요한 역할을 한다. T 세포는 흉선에서 발생하고, 유핵 세포에서 발현되는 주조직적합성복합체(MHC) 분자 상에 제시된 펩티드를 인식할 수 있게 하는 TCR 분자를 표면에 발현시킨다(항원 제시로 공지됨). 병원체로부터 유래된 항원, 즉 MHC 분자에 의해 제시된 외래 항원은 강력한 T 세포 반응을 유도하는 반면, 자가-항원은 일반적으로 상기 T 세포가 발생하는 동안 흉선에서 자가-항원 특이적 T 세포의 음성 선택으로 인해 T 세포 반응을 유도하지 않는다. 따라서 면역계는 외래- 또는 자가-항원을 제시하는 유핵 세포를 구별할 수 있고, 강력한 사이토카인 방출 및 T 세포의 세포 독성 메커니즘을 통해 감염된 세포를 특이적으로 표적화하여 박멸할 수 있다. 면역계의 힘은 미래의 암 요법에 대한 유망한 도구로 인식되어 왔다. 지난 10 년 동안, 생체 외에서 증폭된 환자 유래 림프구의 투여를 수반하는 입양전달(adoptive) 세포 치료(ACT)를 이용하여 T 세포의 독특한 특성을 개발하기 위한 연구가 시작되었다. ACT는 환자의 면역 능력이 필요하지 않기 때문에 암 치료에 대한 매력적인 개념이며, 전달된 림프구의 특이성은 돌연변이가 없어서 면역원성이 낮으므로 통상 자가 T 세포 반응을 효과적으로 유발하지 못하는 종양 항원을 표적으로 할 수 있다. ACT는 다양한 유형의 암에 대해 유망한 치료법으로 여겨졌지만, 임상 치료법으로서의 광범위한 적용은 각 환자로부터의 종양 특이적 T 세포의 맞춤형 단리 및 특성화에 대한 필요성으로 인해 어려움을 겪었다 - 이는 어렵고 시간 소모적일 수 있을 뿐만 아니라 종종 고-결합력(avidity) T 세포를 생산하지 못하는 과정이다(Xue et al,, Clin. Exp. Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248.) 면역 손상 환자에서조차 한정된 항원 특이성을 갖는 종양-반응성 T 림프구의 신속한 생성을 허용하기 때문에, 1차 T 세포로의 종양 항원-특이적 TCR의 유전자 전달은 ACT의 현재 한계의 일부를 극복할 수 있다. 그러나, 종양 항원을 특이적으로 인식하고 생체 내에서 원하는 항 종양 효과를 나타내는 TCR을 갖는 적합한 T 세포 클론의 동정은 여전히 진행중인 연구의 주제이다. 2012년에 전 세계적으로 약 1,410만의 신규 사례의 암이 발생했으며 현재 암이 전 세계 모든 인간 사망의 약 14.6%의 원인이라는 점을 고려할 때 새롭고 효율적인 치료 옵션이 시급히 필요하다. 본 발명의 목적은 상기에 제시된 요구를 충족시키는 것이다. MAGE-A4는 흑색종 항원(MAGE) 패밀리에 속한다. MAGE 패밀리는 흑색종, 결장, 폐에서 유방 및 기타 종양에 이르는 다양한 악성 종양 유형에서 발현된다. 구체적으로, MAGE 패밀리는 조직 발현 패턴에 따라 두 그룹으로 나뉘는 데, MAGE-A 서브패밀리는 고환의 생식 세포에서 발현되고 악성 종양에서 비정상적으로 재발현된다. 이것은 또한 MAGE-A4에도 적용된다. 종양 조직 발현 연구에 따르면 MAGE-A4는 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 19~35%, 유방암 사례의 13%, 상피성 난소암 사례의 47%, 결장직장암 사례의 22%에서 (과)발현되는 것으로 드러났다(Tajima et al. Lung Cancer 2003; 42: 23-33; Gure et al. Clin Cancer Res 2005, 11 :8055-8062; Kim et al. Int J Mol Med 2012, 29: 656-662; Otte et al. Cancer Res 2001, 61 :6682-668; Daudi et al. PLoS One 2014, 9:e104099; Li et al. Clin Cancer Res 2005, 11:1809-1814). 도 1은 상이한 MAGE-A4-반응성 TCR로 형질도입된 CD8+ T 세포의 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 결합을 나타낸다. CD8+ T 세포는 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리되었고 3개의 상이한 MAGE-A4-TCR 및 MAGE-A4를 인식하지 못하는 1개의 대조군 TCR로 형질도입되었다. 형질도입된 CD8+ T 세포는 형질도입을 위한 마커로서 뮤린 불변 베타 영역을 사용하여 FACS에 의해 농축되었다. 이들 세포를 확장한 후, 이들을 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 및 CD8 및 뮤린 불변 베타 영역(mmCb)에 대한 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 집단은 살아있는 CD8+/mCb+ 세포에 게이팅되었고 다량체/CD8의 염색이 나타난다. 도 2는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포가 HLA-A2 상에 제시된 MAGE-A4GVY-펩티드를 인식함을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 MAGE-A4GVY-펩티드가 외부 로딩된 T2 세포 또는 MAGE-A4 유전자가 형질도입된 K562/HLA-A2 세포와 공동 배양하였다. 음성 대조군으로, 대조군 펩티드가 로딩된 T2 세포와 형질도입되지 않은 K562/HLA-A2 세포가 각각 사용되었다. 표적 세포의 인식은 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액에서 IFN-γ 농도를 측정함으로써 분석하였다. 도 3은 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포의 기능적 결합력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 등급화된 농도의 MAGE-A4GVY-펩티드(10-12 M 내지 10-4 M)가 외부 로딩된 T2 세포와 공동 배양하였다. 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 표준 ELISA로 측정했다. 도 4a 내지 도 4c는 HLA-A2 의존적 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포주를 용해시키는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포(TCR-1, TCR-2 및 TCR-3)의 능력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 상이한 MAGE-A4-양성 HLA-A2-양성 종양 세포주(NCI-H1703, NCI-H1755), MAGE-A4-음성 HLA-A2-양성 종양 세포주(Saos-2) 및 MAGE-A4-음성 HLA-A2-음성 종양 세포주(A549)와 공동 배양하였다. MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩된 종양 세포가 양성 대조군으로 사용된다. 형광 마커로 안정적으로 형질도입된 종양 세포주에 대한 세포독성은 IncuCyte® ZOOM 장치(Essen Bioscience)로 2시간마다 사진을 찍어서 측정하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA 세트)로 분석했다. 도 5a 내지 도 5c는 MAGE-A4-TCR-트랜스제닉 T 세포(TCR-1, TCR-2 및 TCR-3)가 정상 인간 세포를 인식하지 못한다는 것을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 상이한 1차 세포 및 필수 조직 또는 기관을 대표하는 유도 만능 줄기 세포(iPS) 유래의 세포와 공동 배양하였다. MAGE-A4GVY-펩티드가 로딩된 정상 세포가 양성 대조군으로 사용된다. HLA-A2 발현은 IFN-γ와의 사전 인큐베이션에 의해 뉴런 상에서 유도되었다. HLA-A2-음성 NHBE 세포를 HLA-A2-ivtRNA로 전기천공하고 모든 세포의 HLA-A2 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 사이토카인 방출을 분석하기 위해, 공동 배양 상청액을 24 시간 후에 수확하고 IFN-γ 및 IL-2 농도를 표준 샌드위치 ELISA(BD 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA 세트)로 분석했다. 도 6은 상이한 MAGE-A4-반응성 완전 인간 TCR로 형질도입된 CD3+ T 세포의 MAGE-A4GVY-MHC-다량체 결합을 나타낸다. CD3+ T 세포를 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리하였으며, 3개의 상이한 MAGE-A4-TCR과 MAGE-A4를 인식하지 못하는 1개의 대조군 TCR로 형질도입하였다. 이들 세포를 확장한 후, MAGE-A4GVY-MHC-다량체 및 CD3에 대한 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 집단은 살아있는 CD3+ 세포 및 다량체 염색에 게이팅되었다. 도 7은 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포가 HLA-A2 상에 제시된 MAGE-A4GVY-펩티드를 인식함을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 MAGE-A4GVY-펩티드가 외부 로딩된 T2 세포 또는 MAGE-A4 유전자가 형질도입된 A549/HLA-A2 세포와 공동 배양하였다. 음성 대조군으로서, 대조군 펩티드가 로딩된 T2 세포 및 형질도입되지 않은 A549/HLA-A2 세포가 각각 사용되었다. 표적 세포의 인식은 Luminex 분석에 의해 공동 배양 상청액의 IFN-γ 농도를 측정함으로써 분석하였다. 도 8은 HLA-A2 의존적 방식으로 MAGE-A4-양성 종양 세포주에 특이적으로 반응하는 MAGE-A4 완전 인간 TCR-트랜스제닉 T 세포의 능력을 나타낸다. 트랜스제닉 T 세포를 여러가지의 MAGE-A4-양성 HLA-A2