KR-20260061959-A - Method for screening therapeutic agent for preterm premature rupture of membrane

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Abstract

본 발명은 (1) 절개 손상(incision damage) 또는 천공 손상을 포함하는 양막 조직에 후보물질을 처리하는 단계; (2) 용액이 담지된 용기의 개구부가 덮이도록 후보물질이 처리된 양막 조직을 용기와 체결하는 단계; 및 (3) 양막을 통한 용액의 누출을 측정하는 단계;를 포함하는 조기 양막파수(preterm premature rupture of membrane) 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

Inventors

장종욱
오수영
최석주

Assignees

사회복지법인 삼성생명공익재단

Dates

Publication Date: 20260506
Application Date: 20241028

Claims (19)

(1) 절개 손상(incision damage) 또는 천공(punch) 손상을 포함하는 양막 조직에 후보물질을 처리하는 단계; (2) 용액이 담지된 용기의 개구부가 덮이도록 후보물질이 처리된 양막 조직을 용기와 체결하는 단계; 및 (3) 양막을 통한 용액의 누출을 측정하는 단계;를 포함하는 조기 양막파수(preterm premature rupture of membrane) 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 절개 손상의 길이가 0.1 mm 내지 20 mm인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (1)에서 양막에 후보물질을 처리 후 후보물질이 처리된 양막을 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 후보물질은 세포, 합성화합물, 천연화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자, 단백질, 당 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (1)에서 상기 후보물질의 처리는 치료제 후보물질을 양막의 절개 손상 또는 천공 손상 부위에 직접 도포 또는 코팅하거나, 양막이 포함된 배양배지에 첨가하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 염료 및 증류수를 포함하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 트리판 블루(Trypan Blue), 헤마톡실린(Hematoxylin), 에오신(Eosin), 및 나프톨 옐로우 S(Naphthol Yellow S)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 용기는 유리(Glass), PETG(Polyethylene Terephthalate Glycol), PETE(polyethylene terephthalate), OPET(oriented polyethylene terephthalate), PCTG(Poly Cyclohexylenedimethylene Terephthalate), PCTC(Polycyclodimethylterephthalate glycol), 폴리에스터, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE) 및 폴리스티렌(PS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어지는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (2)에서 상기 체결은 상기 용기의 개구부를 포함하는 상단의 외주면과 양막의 일부를 탄성 밴드로 조임으로써 고정하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액의 누출은 30초 내지 30분 동안 수행되는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (3)은 흡수 패드 상에 양막이 접촉되도록 양막 조직으로 덮인 용기를 뒤집어 용기 내에 담지된 용액을 누출시킨 후 누출량을 측정하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 단계 (3)에서, 용액의 누출은 양막 조직으로 덮인 개구부에 작용하는 압력이 30 내지 50 mmHg인 조건에서 수행되는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (3)은 감압 또는 가압 환경하에 용기 내에 담지된 용액의 누출을 유발하여 용기의 기밀도를 정량적으로 측정하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제13항에 있어서, 상기 기밀도는 용액의 누출 압력 또는 누출이 시작되는 압력을 측정하는 것인, 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 단계 (3) 이후, (4) 후보물질이 처리된 양막으로부터 누출된 용액의 누출량 또는 기밀도를 후보물질이 처리되지 않은 대조군에서 누출된 용액의 누출량 또는 기밀도와 비교하여, 누출량을 감소시키거나 기밀도를 증가시킨 후보물질을 선별하는 단계;를 더 포함하는 조기 양막파수 치료제의 스크리닝 방법.
상단(21)에 개구부(22)를 포함하고 내부 공간부(23)를 구비한 본체(2); 상기 개구부(21)를 덮고 있는 양막(3); 상기 양막을 고정하는 탄성 밴드(4); 및 내부 공간부(23)에 담지된 용액(5);을 포함하며, 상기 양막의 일부(31)가 상기 상단의 외주면(24)의 일부를 덮고 있고, 상기 양막의 일부(31)가 상기 상단 외주면(24)의 일부가 탄성 밴드(4)로 조임으로 체결되고, 상기 양막은 절개 손상(incision damage) 또는 천공 손상을 포함하는 양막 조직인, 용기.
제16항에 있어서, 상기 양막은 절개 손상(incision damage) 또는 천공 손상을 포함하는 양막 조직에 후보물질이 처리된 것을 포함하는 것인, 용기.
내부 압력의 변화에 기초하여 제13항의 용기의 기밀도를 평가하는 장치(6)로서, 내부에 용기가 수납되는 수납공간(62)이 형성되며, 외부에 대하여 개방 또는 밀봉할 수 있는 밀봉부(63)를 포함하는 진공챔버(61); 및 상기 챔버와 튜브(64)로 연결되어 내부 공간에 압력 변화를 조절하는 제어부(65); 를 포함하는 장치.
제18항에 있어서, 상기 수납공간의 일부에 물(66)이 충전되는 것인, 장치.

Description

조기 양막파수 치료제 스크리닝 방법{Method for screening therapeutic agent for preterm premature rupture of membrane} 본 발명은 신속하고 간편하게 조기 양막파수의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 양막은 태반의 가장 안쪽에 있는 0.02 ~ 0.5 mm의 얇은 막으로 상피층, 기저층, 치밀층, 섬유아세포층, 해면층의 5층으로 구성되고, 신경, 림프관, 혈관 등이 존재하지 않는 무혈관성 기질의 태반막으로 태아를 둘러싸고 있어 모체로부터의 각종 감염 및 면역반응에서 태아를 보호하는 장벽 역할을 한다. 인간의 경우 처음 양막이 형성될 때 양막과 태아가 닿아 있지만, 임신 4-5주가 지나면, 그 안에 양수가 차기 시작한다. 양수가 찰수록 점점 양막은 늘어나게 되고 결국 양막 바깥쪽에 있는 융모막과 맞닿게 되며, 양수는 양막 내부의 태아의 움직임을 자유롭게 해주며 외부의 충격을 완화시키는 역할을 한다. 조기 양막파수(preterm premature rupture of membrane, PPRM)는 임신 중 태아를 둘러싸고 있는 양막에 이상이 생겨 양수가 양막 밖으로 새어 나오는 질환이다. 조기 양막파수(preterm premature rupture of membrane)는 발생 원인에 따라 크게 2가지로 나눌 수 있는데, 산모의 건상상태 또는 염증반응으로 인해 발생하는 자발적 조기 양막파수(spontaneous pPROM)와 산부인과에서 실시하는 양수천자 검사에 의해 발생하는 의인성 조기 양막파수(iatrogenic pPROM)가 있다. 조기 양막파수는 주산기 합병증과 신생아 이환 및 사망의 주원인으로서 신생아 사망의 50%, 조산의 30-40%가 조기 양막파수에 의한 것으로 알려져 있고, 특히 30-50%가 임신 37주 이전에 나타나는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 임신 24∼25주 이전에 조기 양막 파열이 일어나면 태아가 생존하기 힘들기 때문에 유산하기 쉬운데, 이는 조기 양막파수 질환이 부수적으로 자궁내 감염 위험의 심각한 증가와 태아 폐 시스템의 발달 장애를 야기하기 때문이다. 더욱이, 사회가 점차 고령화 되어감에 따라 조산의 빈도가 높아지고 있고, 이에 따라 조기 양막파수 빈도도 함께 급격히 증가하고 있다. 이와 같이 조기 양막파수는 주산기 합병증과 신생아 이환/사망률의 높은 빈도에도 불구하고, 이를 예측하는 방법이나 예방법은 물론 치료적 접근법에 있어서도 아직까지 명확하게 정의되어 있지 않으며, 수행되는 임상적 프로토콜이 매우 제한적이다. 전통적인 치료는 신생아 이환과 사망에 재태 연령이 가장 중요하다는 근거 하에 임신을 유지하여 재태 기간에 따른 보존적 처치(conservative management)에 주안점을 두고 있지만, 많은 산과적 합병증이 발생할 수 있어 조기 양막파수 예방에는 매우 제한적인 처치 방법이다. 또한, 진단적 접근(diagnostic approach)으로 초음파 검사는 그 유용성이 입증되지 않았고, 자궁경관의 내진은 감염의 위험을 증가시키고 임신 유지기간 단축의 위험성이 있기 때문에 여전히 진단적으로도 어려움이 많다. 마지막으로, 현재 진행 중인 치료적 접근(Therapeutic approach)으로 항생제 및 부신피질호르몬 투여는 태아성장, 부신기능, 뇌신경학적 성장과 생존율에 나쁜 영향을 미칠 수 있기 때문에, 장기적인 치료적 접근으로 적절하지 못하다. 위와 같은 상황 하에 조기 양막파수의 치료제를 개발하기 위한 시도들이 일부 확인되었다. 일 예시로, 임신한 포유동물(예, rat)의 양막에 인위적으로 손상을 준 후 치료제를 처리하여 치료 효능을 보는 것과 같은 실험 방법들이 일부 알려져 있지만, 동물윤리적으로 바람직하지 못하며 동물모델의 구축 및 치료 효능 확인까지 많은 시간과 비용이 소요되는 문제가 있다. 이러한 배경하에서, 본 발명자는 조기 양막파수 치료제 개발에 있어서 생체 외에서 빠르고 간편한 방법으로 치료 물질 선별을 위한 신규 스크리닝 시스템을 개발하여 본 발명을 완성하였다. 도 1은 절개 손상을 포함하지 않은 정상 대조군의 양막(a), 절개손상이 생성된 양막(b) 및 절개 손상이 생성된 양막에 후보물질 처리(c)를 나타낸 모식도이다. 도 2는 실시예 1에 따라 제조된 조기 양막파수 치료제를 스크리닝할 수 있는 용기를 나타낸 그림이다. 도 3은 용기를 이용하여 양막을 통해 용액을 누출시키는 모습을 나타낸 그림이다. 도 4는 용기를 이용하여 양막을 통해 누출된 용액의 누출량의 확인한 이미지(a) 및 이를 정리한 그래프(b)이다. 도 5는 조기 양막파수 치료제를 스크리닝할 수 있는 용기를 도시한 단면도이다. 도 6은 정상 대조군(정상 양막), 질환 대조군(손상 양막), 실험군(손상 양막에 치료 후보물질 처리)의 조건을 간략히 나타낸 그림이다. 도 7은 각 조건에 따른 양막 조직을 테스트 용기에 체결한 이미지(a) 및 이를 테스트 용기를 수조 내 설치하여 외부 압력 변화에 의한 기밀도를 측정하는 단계를 나타낸 이미지(b)로써, 조기 양막파수 질환 모델의 정량적 기능성 평가 시스템을 간략히 나타낸 그림이다. 도 8은 조기 양막파수 질환 모델의 정량적 기능성 평가 방법에서, 테스트 용기가 기밀성을 유지하는 경우의 압력(a) 및 누출이 진행되는 경우의 압력(b) 양상을 나타낸 그림이다. 도 9는 조기 양막파수 질환 체외 모델의 각 실험군에 대한 가압 환경에서의 기밀도 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 그래프에서 질환 대조군은 각각 16G, 19G, 20G 니들을 이용한 손상 양막을, 실험군은 줄기세포(MSC)로 처리된 16G, 19G, 20G 니들 손상 양막을 사용하였다. 도 10은 조기 양막파수 치료제를 스크리닝할 수 있는 용기 및 감압 또는 가압 펌프를 포함하는 기밀도 평가 시스템을 도시한 단면도이다. 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)의 세포 배양 시 MEM Alpha (Minimum Essential Medium, Gibco), FBS (Fetal Bovine Serum,Gibco), Gentamicin Reagent Solution (Gibco)을 사용하였다. 조기 양막파수 체외 모델을 위하여 용기는 Nalgene™ Square PETG Media Bottles with Septum Closure: Sterile, Shrink-Wrapped Trays을 Thermo Scientific™에서 구매하였다. 실시예 1. 조기 양막파수 체외 모델 제조 및 이를 이용한 치료제 스크리닝 방법 (1) 중간엽 줄기세포 배양(후보물질) 세포주 와튼 젤리 유래 중간엽 줄기세포 (WJ-MSC)를 90% MEM Alpha, 10% 소 태아형 FBS 및 0.5% gentamicin가 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. (2) 절개 손상이 생성된 양막 제조 산모의 동의 하에 출산 과정중 버려지는 태반으로부터 양막 조직을 수령하였다(삼성서울병원 산부인과). 구체적으로, 탯줄이 있는 부분이 위를 향하도록 한 후, 태반을 무균 field에 놓았다. 이후 태반에 가깝게 탯줄을 손질하고, X-모양으로 절개하여 양막에 남아있는 혈액(blood)을 씻어낸 후 sterile bottle에 넣어 수령하였다. 수령된 양막에서 혈전을 제거하기 위해 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered salin)를 이용하여 3~4번 세척하였다. 양막의 단면적이 60 mm가 넘지 않게 제작하였으며(도 1(a)), 여기에 의료용 칼 11호(PARAGON)를 사용하여, 일정 깊이만큼 절개 손상(incision damage)을 생성하였다(도 1(b)). 절개 손상을 포함하는 양막이 마르지 않도록 DPBS에 넣어 보관하였다. (3) 절개 손상이 생성된 양막에 후보물질 처리 절개 손상이 포함된 양막 조직을 60pi dish에 옮긴 후, 세포 배양배지를 채웠다. 이후 배양된 WJ-MSC(후보물질)를 5×105 cells/100ul로 양막의 절개 손상 부위에 직접 시딩(seeding) 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다(도 1(c)). (4) 조기 양막파수 치료제 스크리닝용 용기 제조 Square PETG Media Bottle (60mL, Nalgene™)에 0.01 % Trypan blue 용액 및 증류(60 mL)이 혼합된 용액을 채운 후, 용기의 입구를 상기 24시간동안 배양된 양막으로 덮고 고무줄을 이용하여 양막이 고정되도록 단단히 체결하였다. 이때 절개 손상 부분이 입구 상에 위치하도록 한다(도 2). 조기 양막파수 치료제 스크리닝용 용기의 전체 단면도는 도 5에 나타내었다. (5) 기능성 평가(용액 누출 및 누출량 측정) 제조된 스크리닝용 용기를 흡수 패드(diaper)([CNL] DELUXE DOG PADS 80 g/600x760 mm) 상에 뒤집어 양막 부분이 흡수 패드상에 접촉되도록 하여 1분 동안 유지하였다(도 3). 이후, 양막의 절개 손상을 통해 용액이 새어 나오는지 여부를 흡수 패드에 흡수된 용액의 양을 육안으로 확인하거나, 정량화하였다. 실시예 2. 조기 양막파수 치료제 스크리닝 실시예 1에서 용기를 흡수 패드([CNL] DELUXE DOG PADS 80 g/600x760 mm) 상에 뒤집어 양막 부분이 흡수 패드상에 접촉되도록 하여 1분 동안 유지한 후 흡수 패드를 카메라로 촬영하고, 양막으로부터 새어나온 용액의 영역을 ImageJ를 활용하여 정량화하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 후보물질을 처리하지 않은 대조군(#2 Ctrl)에 대비하여 후보물질인 WJ-MSC를 처리한 실험군(#2+WJ-MSC)에서 흡수 패드상에 용액의 누출이 거의 일어나지 않은 것을 육안으로 확인할 수 있었다(도 4(a)). 또한, 이를 정량화한 그래프를 통해 후보물질인 WJ-MSC를 처리한 실험군에서 흡수 패드상에 용액의 누출이 거의 일어나지 않은 것을 정량적으로 확인할 수 있었다(도