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KR-20260062015-A - COMPOSITION COMPRISING POLYMER-COATED ZINC OXIDE NANOPARTICLE-CONTAINING STEM CELLS FOR PREVENTION OR TREATMENT OF LIVER DISEASES AND MANUFACTURING METHOD THEREOF

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Abstract

본 발명은 고분자 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고분자 코팅 산화아연 나노입자는 기존 금속산화물 나노입자에 비해 수상에서의 분산력이 우수하며 방출된 금속이온이 정상세포에 미치는 독성을 최소화할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 산화아연 나노입자 함유 줄기세포는 기존 줄기세포에 비해 염증 억제 관련 사이토카인 분비능 및 면역세포 활성 억제능이 우수하여 간질환을 예방 및 치료하기 위한 세포 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Inventors

  • 나건
  • 박나은

Assignees

  • 가톨릭대학교 산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20250317
Priority Date
20241028

Claims (8)

  1. (a) 고분자가 코팅된 산화아연 나노입자; 및 (b) 줄기세포;를 포함하는 줄기세포 치료제로서, 상기 줄기세포는 산화아연 나노입자가 세포 내부로 함침되어 존재하는 것인, 간 질환 예방 또는 치료용 줄기세포 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Poly ethylene glycol), 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol), 덱스트란(Dextran), 전분(Starch), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethylene oxide), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴릭애씨드(Polyacrylic acid), 폴리스타이렌설포닉엑시드(Polystyrenesulfonic acid), 폴리실릭익엑시드olysilicic acid), 폴리포스포릭엑시드(Polyphosphoric acid), 폴리에틸렌설포닉엑시드(Polyethylene sulfonic acid), 폴리말레익엑시드(Polymaleic acid) 및 폴리아마인스(Polyamines)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 치료제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 고분자는 형광염료가 공유결합으로 연결된 고분자를 포함하는 것인, 치료제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 치료제.
  5. 제1항에 있어서, 간 질환은 비알콜성 지방성 간염(NASH), 비알콜성 지방간(NAFLD), 알콜성 지방성 간염(ASH), 알콜성 지방간 (AFLD), 간부전증, 간 섬유화 및 간경화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 치료제.
  6. 고분자가 코팅된 산화아연 나노입자가 세포 내부로 함칩되어 존재하는 줄기세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 활성산소종 및 측분비인자를 분비하는 것인, 줄기세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 측분비인자는 혈관 생성인자 (angiogenic factors), 성장인자 (growth factors), 케모카인 (chemokine), 전염증성 사이토카인 (pro-inflmmatory cytokine), 항염증 사이토카인 (anti-inflammatory cytokine) 및 엑소좀 (exosome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 줄기세포.

Description

고분자 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 제조방법 {COMPOSITION COMPRISING POLYMER-COATED ZINC OXIDE NANOPARTICLE-CONTAINING STEM CELLS FOR PREVENTION OR TREATMENT OF LIVER DISEASES AND MANUFACTURING METHOD THEREOF} 본 발명은 고분자 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 간은 신체의 대사과정에 관여하는 장기로 매우 중요한 기능을 담당하고 있다. 간은 섭취하는 음식물들을 여러 조직에서 필요한 영양소의 형태로 적절하게 변환시키고, 조직에서 이용하고 남은 노폐물들을 다시 간으로 운반하여 처리하는 대사기능을 한다. 간의 첫 번째 기능은 탄수화물, 단백질, 지방을 대사하며 담즙을 생성하고 배출하는 역할을 하는 것이다. 두 번째 기능은 인체가 기능하는데 필요한 물질들을 합성하고 혈중으로 배출하는 것이다. 즉, 혈액응고에 필요한 혈장 단백질, 몸의 부종에 관여하는 알부민 등 인체에서 필요한 영양소를 합성하여 기본적인 신체 기능을 유지시킨다. 또한, 해독기능이 있어 유해한 물질들이 체내에 침입하면 해로운 물질을 파괴하여 보호하고 독소를 해독하는 기능을 수행한다. 간질환은 사망률이 매우 높은 질환으로 예방 및 치료에 관한 연구가 요구된다. 만성 간질환의 경우 간경변으로 진행된 이후에 발생하기 때문에 간염에서 간경변으로 진행을 막는 것이 간질환 치료의 궁극적인 목표이다. 간세포는 재생 능력이 매우 강하지만, 섬유화 정도가 높아질수록 재생되지 않고 간 조직이 딱딱하게 굳어진다. 간 섬유화란 간염에서 간경변으로 진행되는 과정을 의미하여 일반적으로 바이러스, 알코올 및 여러 독성물질에 의해 간세포가 손상을 받으면 쿠퍼 세포의 대식활동으로 인해 여러 종류의 사이토카인을 통해 간성상 세포를 증식 및 활성화시킨다. 활성화된 간성상 세포는 세포외기질 (extracelluar matrix, ECM)을 생성한다. 지속적으로 간손상이 유발되는 만성 간질환의 경우 조직 간의 교차결합으로 인해 두꺼운 원섬유가 축적되어 비가역적인 간경변으로 진행된다. 연구되고 있는 대부분의 치료제는 치료효과가 매우 미약하거나 심한 부작용으로 인해 현재까지 간섬유화 표준 치료제가 없는 실정이다. 글로벌 제약사들에 의해 비알콜성 치료제 개발이 활발하게 진행 중이지만, 현재까지 간섬유화 특이적 치료제는 승인된 바가 없다. 따라서 지금까지의 치료제의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 접근법이 필요하다. 이에 본 발명자들은 예의 노력한 끝에 수상에서 산화아연 나노입자의 분산력을 높이고 생체 내 주입 후 거동을 확인하기 위하여 표면에 고분자를 합성하여 코팅하고 이를 줄기세포에 처리하였다. 산화아연 나노입자에 의해 발생하는 활성산소에 의한 줄기세포의 측분비 인자 분비 조절 및 면역세포 활성을 억제시킴에 따른 간질환 치료효과를 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다. 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자 모식도를 나타낸 도면이다. 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 (PEG2K-Dye)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자 (PZnONP) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화알루미늄 나노입자 (PAlONP) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화철 나노입자 (PFeONP) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화마그네슘 나노입자 (PMgONP) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 6k-형광염료 (PEG6K-Dye)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 pH 7.5 수용액상 입자 사이즈 및 제타 전위를 나타낸 도면이다. 도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 pH 6.5 수용액상 입자 사이즈 및 제타 전위를 나타낸 도면이다. 도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 X-선 회절 분석 스펙트럼을 나타낸 도면이다. 도 11은 본 발명의 일실시예에 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 원평광 이색성을 측정한 도면이다. 도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 금속산화물 나노입자의 L929 세포독성을 MTT assay를 통해 확인한 도면이다. 도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 금속산화물 나노입자의 줄기세포 독성을 MTT assay를 통해 확인한 도면이다. 도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 금속산화물 나노입자를 줄기세포에 처리 후 줄기세포에서 분비되는 염증성 인자 (IL-1 β)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 금속산화물 나노입자를 줄기세포에 처리 후 줄기세포에서 분비되는 금속단백질분해효소 조직억제제 (TIMP-1)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 금속산화물 나노입자를 줄기세포에 처리 후 줄기세포에서 분비되는 항염증 인자 (IL-10)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 줄기세포 내 함입 정도 및 유지기간을 유세포 분석기를 통해 정량평가한 도면이다. 도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 줄기세포 내 함입 정도 및 유지기간을 형광 염색을 통한 이미지로 나타낸 도면이다. 도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 줄기세포 내 활성산소 발생 정도는 DCFDA 형광 염색을 통해 이미지로 확인한 도면이다. 도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포의 호밍효과 (homing effect)을 transwell로 확인한 도면이다. 도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자의 줄기세포 내재화 및 리소좀 co-localization을 공초점현미경을 통해 확인한 도면이다. 도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포 내부 아연 이온의 존재 유무 및 축적되는 정도를 공초점현미경을 통해 측정한 도면이다. 도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 줄기세포에 처리 후 줄기세포에서 분비되는 항염증 및 줄기세포 생존 촉진 인자(VEGF, TGF-β, IDO 및 IL-8)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 염증성 환경에 존재하는 줄기세포에 처리 후 줄기세포에서 분비되는 항염증 및 염증 촉진 인자(IFN-γ, IL-6, TNF-α 및 IL-10)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 줄기세포에 처리 후 시간(30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간)에 따른 세포막 과산화 현상을 형광 이미지로 나타낸 도면이다. 도 26은 본 발명의 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자에 의해 줄기세포 ADSC의 측분비 활성이 촉진되는 것을 확인한 결과로, 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 줄기세포에 처리 후 시간에 따라 줄기세포에서 분비되는 엑소좀을 BCA 분석법과 표면 마커 CD9 및 CD63으로 염색하여 형광 이미지로 확인한 결과이다. 도 27은 본 발명의 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 처리한 줄기세포 ADSC에서 분비되는 보호성 인자에 의해, 간세포 (Hepatocyte cell, HepG2)의 생존율이 증가하는 것을 확인한 결과이다. 독성물질인 (a) 사염화탄소 (Carbon tetrachloride, CCL4)와 (b) 아세트아미노펜 (Acetaminophen, APAP)을 간세포에 처리한 후 탈수소효소 (Lactate dehydrogenase, LDH) 측정을 통해 세포 독성을 확인한 결과이다. 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 처리한 줄기세포를 (a) 사염화탄소와 (b) 아세트아미노펜을 처리한 간세포와 공동 배양하였을 때, 간세포의 세포 생존율이 증가된 것을 MTT assay를 통해 확인한 도면이다. 도 28은 본 발명의 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 처리한 줄기세포를 사염화탄소를 처리한 간세포와 공동 배양하였을 때, 간세포에서 분비되는 염증성인자 (IL-33, NO 및 IL-13)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 29는 본 발명의 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자를 처리한 줄기세포를 아세트아미노펜을 처리한 간세포와 공동 배양하였을 때, 간세포에서 분비되는 염증성인자 (IL-33, NO 및 IL-13)의 농도를 ELISA를 통해 확인한 도면이다. 도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 2k-형광염료 코팅 산화아연 나노입자 함유 줄기세포 조성물의 치료효과를 급성간부전 동물모델에서 확인하기 위하여 모델 유도 방법을 나타낸 도면이다