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KR-20260062099-A - 리소좀 장애를 치료하기 위한 변이된 TFEB

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Abstract

본 발명은 천연 엑손 3이 제거된 변이된 전사 인자 EB(TFEB) 단백질에 관한 것이다. 이 단백질을 본 명세서에서는 "TFEB-Δex3" 또는 "Δex3-TFEB"라고 한다. 본 발명은 또한 이 변이된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 TFEB의 엑손 3 제거가 필요한 환자에게 사용하기 위한 생체분자 도구에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리소좀 축적 장애 및 리소좀 기능장애를 특징으로 하는 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 이들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Inventors

  • 드루게르, 마린
  • 샤르베리아, 마튀
  • 베이즈, 줄리앙

Assignees

  • 테라네수스

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240729
Priority Date
20230728

Claims (20)

  1. 변이된 TFEB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로서, 여기서, 변이된 TFEB 단백질은 천연 엑손 3에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 상기 벡터는 바람직하게는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  2. 변이된 TFEB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로서, 상기 단백질의 mRNA 서열은 SEQ ID NO: 10의 mRNA 서열을 포함하지 않으며, 상기 벡터는 바람직하게는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 엑손 3에 의해 인코딩되고, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 변이체는 제거되었거나 존재하지 않는 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변이된 TFEB 단백질은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9 중 임의의 하나의 변이체 또는 상동체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변이된 TFEB 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 11-14 또는 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 벡터.
  6. TFEB 단백질의 엑손 3의 엑손 스키핑(exon skipping)을 매개할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 분자.
  7. 제6항에 있어서, TFEB 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에서 엑손 3의 엑손 스키핑을 매개할 수 있는 분자.
  8. 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 이들의 변이체 또는 상동체의 TFEB 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 엑손 3의 엑손 스키핑을 매개할 수 있는 분자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 3은 SEQ ID NO: 6에 도시된 아미노산 서열을 인코딩하는 분자.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 인트론 2-3, 엑손 3, 인트론 3-4 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열에 위치한, 바람직하게는 인트론 2-3을 인코딩하는 핵산 서열부터 엑손 3을 포함하여 인트론 3-4를 인코딩하는 핵산 서열까지의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는(또는 표적으로 하거나, 이에 상보적이거나, 이에 혼성화되거나, 또는 이들의 임의의 조합) 분자.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 인트론 2-3, 엑손 3, 인트론 3-4 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열에 위치한, 바람직하게는 인트론 2-3을 인코딩하는 핵산 서열부터 엑손 3을 포함하여 인트론 3-4를 인코딩하는 핵산 서열까지의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 연속적인 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는(또는 표적으로 하거나, 이에 상보적이거나, 이에 혼성화되거나, 또는 이들의 임의의 조합) 분자.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 214 내지 1402(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 236 내지 1424(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 연속적인 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 269 내지 621(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 269 내지 621(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 연속적인 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 339 내지 436(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 339 내지 436(포함)의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 연속적인 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 339 내지 435, 바람직하게는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 339 내지 434, 보다 바람직하게는 339 내지 433, 보다 바람직하게는 339 내지 432, 보다 바람직하게는 340 내지 431, 보다 바람직하게는 340 내지 430, 보다 바람직하게는 340 내지 429, 보다 바람직하게는 340 내지 428, 보다 바람직하게는 340 내지 427, 보다 바람직하게는 340 내지 426, 보다 바람직하게는 340 내지 425, 보다 바람직하게는 340 내지 424, 보다 바람직하게는 340 내지 423, 보다 바람직하게는 340 내지 422, 보다 바람직하게는 341 내지 421, 보다 바람직하게는 341 내지 420, 보다 바람직하게는 341 내지 419, 보다 바람직하게는 341 내지 418, 보다 바람직하게는 341 내지 417, 보다 바람직하게는 341 내지 416, 보다 바람직하게는 341 내지 415, 보다 바람직하게는 341 내지 414, 보다 바람직하게는 341 내지 413, 보다 바람직하게는 341 내지 412, 보다 바람직하게는 342 내지 411, 보다 바람직하게는 342 내지 410, 보다 바람직하게는 342 내지 409, 보다 바람직하게는 342 내지 408, 보다 바람직하게는 342 내지 407, 보다 바람직하게는 342 내지 406, 보다 바람직하게는 342 내지 405, 보다 바람직하게는 342 내지 404, 보다 바람직하게는 342 내지 403, 보다 바람직하게는 342 내지 402, 보다 바람직하게는 342 내지 401, 보다 바람직하게는 342 내지 400, 보다 바람직하게는 342 내지 399, 보다 바람직하게는 342 내지 398, 보다 바람직하게는 342 내지 397, 보다 바람직하게는 342 내지 396, 보다 바람직하게는 342 내지 395, 보다 바람직하게는 342 내지 394, 보다 바람직하게는 342 내지 393, 보다 바람직하게는 342 내지 392, 보다 바람직하게는 342 내지 391, 보다 바람직하게는 342 내지 390, 보다 바람직하게는 342 내지 389, 보다 바람직하게는 342 내지 388, 보다 바람직하게는 342 내지 387, 보다 바람직하게는 342 내지 386, 보다 바람직하게는 342 내지 385, 보다 바람직하게는 342 내지 384, 보다 바람직하게는 342 내지 383, 보다 바람직하게는 342 내지 382의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 339 내지 435, 바람직하게는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 339 내지 434, 보다 바람직하게는 339 내지 433, 보다 바람직하게는 339 내지 432, 보다 바람직하게는 340 내지 431, 보다 바람직하게는 340 내지 430, 보다 바람직하게는 340 내지 429, 보다 바람직하게는 340 내지 428, 보다 바람직하게는 340 내지 427, 보다 바람직하게는 340 내지 426, 보다 바람직하게는 340 내지 425, 보다 바람직하게는 340 내지 424, 보다 바람직하게는 340 내지 423, 보다 바람직하게는 340 내지 422, 보다 바람직하게는 341 내지 421, 보다 바람직하게는 341 내지 420, 보다 바람직하게는 341 내지 419, 보다 바람직하게는 341 내지 418, 보다 바람직하게는 341 내지 417, 보다 바람직하게는 341 내지 416, 보다 바람직하게는 341 내지 415, 보다 바람직하게는 341 내지 414, 보다 바람직하게는 341 내지 413, 보다 바람직하게는 341 내지 412, 보다 바람직하게는 342 내지 411, 보다 바람직하게는 342 내지 410, 보다 바람직하게는 342 내지 409, 보다 바람직하게는 342 내지 408, 보다 바람직하게는 342 내지 407, 보다 바람직하게는 342 내지 406, 보다 바람직하게는 342 내지 405, 보다 바람직하게는 342 내지 404, 보다 바람직하게는 342 내지 403, 보다 바람직하게는 342 내지 402, 보다 바람직하게는 342 내지 401, 보다 바람직하게는 342 내지 400, 보다 바람직하게는 342 내지 399, 보다 바람직하게는 342 내지 398, 보다 바람직하게는 342 내지 397, 보다 바람직하게는 342 내지 396, 보다 바람직하게는 342 내지 395, 보다 바람직하게는 342 내지 394, 보다 바람직하게는 342 내지 393, 보다 바람직하게는 342 내지 392, 보다 바람직하게는 342 내지 391, 보다 바람직하게는 342 내지 390, 보다 바람직하게는 342 내지 389, 보다 바람직하게는 342 내지 388, 보다 바람직하게는 342 내지 387, 보다 바람직하게는 342 내지 386, 보다 바람직하게는 342 내지 385, 보다 바람직하게는 342 내지 384, 보다 바람직하게는 342 내지 383, 보다 바람직하게는 342 내지 382의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 연속적인 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분자는 TFEB의 엑손 2 내지 인트론 10을 인코딩하는 핵산 서열의 핵산 잔기 342 내지 369 또는 핵산 잔기 358 내지 381의 핵산 서열에 위치한 12 내지 40개의 핵산 잔기로 이루어진 핵산 서열을 대상으로 하는 분자.

Description

리소좀 장애를 치료하기 위한 변이된 TFEB 본 발명은 천연 엑손 3이 제거된 변이된 전사 인자 EB(TFEB) 단백질에 관한 것이다. 이 단백질을 본 명세서에서는 "TFEB-Δex3" 또는 "Δex3-TFEB"로 지칭한다. 본 발명은 또한 이 변이된 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 TFEB의 엑손 3 제거가 필요한 환자에서 이를 제거하기 위한 생체분자 도구에 관한 것이다. 본 발명은 특히 TFEB 단백질의 엑손 3의 엑손 스키핑(exon skipping)을 매개할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리소좀 축적 장애 및 리소좀 기능장애를 특징으로 하는 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 상기 변이된 TFEB 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드, 상기 벡터, 상기 분자 또는 이들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 리소좀은 단백질, 글리코사미노글리칸(GAG), 핵산, 지질 및 탄수화물의 분해를 담당하는 막으로 둘러싸인 세포소기관이다. 액포형 ATPase(V-ATPase)로 알려진ATP 의존성 양성자 펌프(ATP-dependent proton pump)와 60개 이상의 가수분해 효소에 의해 산성의 내부 pH가 유지되며, 이 효소들은 노폐물의 분해 및 재활용을 조절한다. 초기에는 정적이고 최종의 폐기된 세포로 여겨졌던 리소좀은 수동적인 수용체로 생각되었다. 그러나 최근 리소좀은 유전자 조절, 분비, 세포 리모델링, 세포 부착, 발생, 분화, 세포 이동, 세포사멸 및 지질 수송에 중요한 역할을 하는 역동적인 중심부로 밝혀졌다. 더욱이, 현재 그들은 세포 스트레스와 질병에 대한 적응에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이를 위해 리소좀은 변형, 분열, 융합을 겪을뿐만 아니라 다양한 세포 내 성분들과 상호작용할 수 있다. 2009년, Sardiello, Ballabio 및 동료 연구진은 리소좀 단백질의 조화롭게 발현되는 유전자 네트워크를 발견함으로써 이 가설을 확인하였다(Sardiello M. et al., Science 2009, vol.325, p.473-476). 리소좀 단백질 프로모터 영역에 대한 패턴 발견 분석 결과 공통 모티프가 발견되었으며, 연구진은 이를 CLEAR(Coordinated Lysosomal Expression and Regulation) 요소라고 명명하였다. CLEAR는 전사 시작 부위(TSS)로부터 200bp 이내에 우선적으로 위치하는 10개 염기로 이루어진 회문형 서열이다(5'-GTCACGTGAC-3' - SEQ ID NO:139). 이는 오토파고좀(autophagosome) 형성, 오토파고좀-리소좀 융합, 하이드롤라아제 효소 발현 및 리소좀 엑소사이토시스(exocytosis)를 유도하는 유전자의 조절 영역에 존재한다. 전사 인자 EB(TFEB)는 이 CLEAR 컨센서스 서열에 직접 결합하는 포유류 전사 인자이다. 그것의 활성을 조절함으로써, TFEB는 각 세포의 분해 경로에 대한 온디맨드 제어(on-demand control)를 조정한다. 특히, TFEB가 CLEAR에 결합하면 오토파지(autophagy) 활성화를 포함하여 리소좀 생물발생(biogenesis) 및 기능이 조절된다. 구조적으로 TFEB는 DNA 결합, 헬릭스-루프-헬릭스 및 류신 지퍼(bHLH-Zip) 도메인을 포함하여 세 가지 기능성 도메인을 포함하며, 소안구증/전사 인자 E(microphthalmia/transcription factor E, MiT/TFE) 계열의 다른 구성원인 소안구증 관련 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF), 전사 인자 E3(TFE3) 및 전사 인자 EC(TFEC)에서도 발견된다(Da Costa et al., Fundamental & Clinical Pharmacology, 2020, doi:10.1111/fcp.12634). 리소좀의 생물발생은 복잡하며, 대략 60여 종에 달하는 하이드롤라아제(글리코시다아제, 프로테아제, 리파아제, 뉴클레아제, 포스파타아제 및 설파타아제) 뿐만 아니라 막관통 및 보조 단백질의 지속적인 합성이 필요하다. TFEB가 리소좀의 생물발생을 제어하는 범위를 결정하기 위해, Palmieri와 동료 연구진은 TFEB 매개 전사 조절을 분석하는 TFEB 단백질 상호작용자에 대한 ChIP-seq 분석과 HeLa 세포에서 TFEB 표적 부위의 게놈 전체 매핑 및 공동 발현 분석을 수행하였다(Palmieri et al., Hum. Mol. Genet. 2011, 20 3852-66, doi:10.1093/hmg/ddr306). 이 연구를 통해 471개의 TFEB 표적이 밝혀졌다. 그 결과 상호작용자들은 예상대로 오토파지 유전자로부터, 리소좀 효소들과 그들의 수용체, 리소좀 막 단백질, 리소좀 산성화에 관여하는 유전자, 리소좀의 위치결정, 및 리소좀의 생물발생에 관여하는 비-리소좀 단백질에 이르기까지 여러 범주로 분류될 수 있다. TFEB 활성은 그것의 핵 위치에 크게 의존한다. 따라서, 핵 신호전달 경로는 TFEB 활성을 강력하게 조절한다. 특히, TFEB의 핵 위치는 특정 세린 인산화에 의해 제어되는 것으로 알려져 있다. 기아 상태와 유사하게, 특정 인산화의 약리학적 또는 유전자 돌연변이에 기반한 억제는 TFEB를 활성화하여 오토파지를 유도한다. 그러므로, 세린 잔기를 치환하거나 변경하여 인산화에 둔감하게 만들어 탈인산화 상태를 유지하도록 하는 방법이 제안되었다(예: US9193755 참조). 또한 TFEB의 핵외 수송은 핵 위치 신호(NLS)를 통해 매개되는 것으로 알려져 있다. 다른 연구자들은 이 위치 신호(NLS)가 변이된 TFEB(NLS의 두 개의 염기성 아르기닌 잔기가 알라닌에 의해 대체되어 변이된 TFEB 단백질에 해당하는 "ΔNLS-TFEB")가 구조적인 세포질 위치를 나타냄을 보여주었다(Napolitano et al. Nature Communication, 2018, 9:3312, doi:10.1038). 다른 연구자들은 TFEB 단백질의 C-말단에 NLS를 추가하여 주로 핵을 표적으로 하는 키메라 분자를 얻는 것을 제안하였다(WO 2010/092112). 마지막으로, TFEB는 N-말단 부분에 핵외 수송 신호(nuclear export signal, NES)를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 NES는 진화적으로 매우 잘 보존된 CRM1 컨센서스 소수성 서열이다. 이들 보존된 잔기 중 세 개의 돌연변이유발은 TFEB의 세포질 재배치를 완전히 손상시킨다는 것이 밝혀졌다(Napolitano et al. Nature Communication, 2018, 9:3312, doi:10.1038). 정상적인 제거(health clearance)를 촉진하는 데 있어 TFEB 및 CLEAR의 역할에 대한 이해의 증대와 더불어, 다양한 동물 질병 모델에서의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 전임상 연구 결과는 TFEB의 약리학적 활성화가 독성 단백질을 제거하여 희귀하고 일반적인 형태의 리소좀성 및 신경퇴행성 질병을 치료할 수 있다는 결론을 뒷받침한다. 현재 TFEB를 표적으로 하는 치료법이나 승인된 치료는 존재하지 않는다. 또한, 이러한 질병 중 일부에 대한 치료를 연구하기 위한 임상 시험이 진행 중이지만, 대부분의 리소좀 축적 장애 또는 리소좀 기능장애를 특징으로 하는 많은 장애에 대해서는 현재 승인된 치료는 없다. 그러므로, 리소좀 제거의 향상 및 세포 응집체의 제거를 기반으로 한 리소좀 축적 장애 및 리소좀 기능장애를 특징으로 하는 장애를 효과적으로 치료할 수 있는 조성물 및 방법에 대한 당업계의 요구가 여전히 존재한다. 도 1은 Hela 세포에서 TFEB 엑손 3 결실(TFEB-ΔEx3) 및 엑손 3을 포함하는 TFEB(TFEB-WT)의 렌티바이러스 감염이 TFEB 전좌(translocation)에 미치는 영향을 도시한다. a. Hela 세포에 TFEB-WT 또는 TFEB-ΔEx3를 코딩하는 렌티바이러스를 일시적으로 감염시킨 후 현미경으로 분석하였다. b. 세포를 분석하여 TFEB 전좌의 백분율, 즉 핵과 세포의 c-Myc 형광 강도의 비율을 계산하였다. 결과는 평균±SEM이다. ****p<0.0001, 양측 독립표본 검정(Two-tailed Unpaired test). WT: 야생형. 도 2: iPSC 유래 뉴런에서 TFEB 엑손 3 결실(TFEB-ΔEx3)이 TFEB 전좌에 미치는 영향 평가. a. iPSC 유래 뉴런에 TFEB-WT 또는 TFEB-ΔEx3를 일시적으로 감염시키고, 100mM 트레할로스 또는 비히클로 처리한 후 현미경으로 분석하였다. b. a에서 설명한 뉴런을 분석하여 TFEB 전좌의 백분율, 즉 핵과 세포의 TFEB 형광 강도의 비율을 계산하였다. c. 평균 세포 강도는 총 TFEB 강도 밀도와 세포의 총 면적 간의 비율로 계산하였다. 결과는 평균±SEM이다. *p<0.05, 일원 분산 분석(One-Way ANOVA), 터키 다중 비교 검정(Tukey's multiple comparisons test). ns: 유의하지 않음, WT: 야생형. 도 3: Hela 세포에서 TFEB 엑손 3 결실(TFEB-ΔEx3)의 안정적인 렌티바이러스 감염이 해당 단백질의 전좌에 미치는 영향 평가. a. Hela 세포에 TFEB-WT 또는 TFEB-ΔEx3를 안정적으로 감염시킨 후 현미경으로 분석하였다. b. a에서 설명한 세포를 분석하여 TFEB 전좌의 백분율, 즉 핵과 세포의 TFEB 형광 강도의 비율을 계산하였다. 결과는 평균±SEM이다. ****p<0.0001, 양측 독립표본 검정. WT: 야생형. 도 4: Hela 세포에서 TFEB 엑손 3 결실(TFEB-ΔEx3)의 안정적인 렌티바이러스 감염이 CLEAR 활성화에 미치는 영향 평가. a. Hela 세포에 TFEB-WT 또는 TFEB-ΔEx3를 안정적으로 감염시키고 나서, CLEAR 렌티바이러스를 일시적으로 감염시키고 현미경으로 분석하였다. b. a에서 설명한 세포를 분석하여 GFP 형광 강도의 백분율을 계산하였다. 결과는 평균±SEM이다. ****p<0.0001, 일원 분산 분석,